穩(wěn)定支持小反芻獸疫病毒增殖的永生化羊源細(xì)胞系構(gòu)建及鑒定.pdf

1、小反芻獸疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)作為副黏病毒科麻疹病毒屬的一個(gè)重要組成成員，在臨床上能夠引起野生和家養(yǎng)小反芻動(dòng)物發(fā)病，以高熱，肺炎，腹瀉和呼吸道黏膜炎癥為主要特征。PPRV屬于有囊膜的單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組大小為15948nt，編碼8個(gè)蛋白（N、P、C、V、M、F、HN和L）。
　　動(dòng)物細(xì)胞系是病毒基礎(chǔ)研究和應(yīng)用的主要平臺(tái)之一。然而，有許多病毒因缺乏能支持其穩(wěn)定增殖的

2、細(xì)胞系，例如PPRV和RHDV等。而導(dǎo)致其相關(guān)基礎(chǔ)和應(yīng)用研究工作進(jìn)展十分緩慢。為解決該技術(shù)瓶頸，原代細(xì)胞的永生化技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。
　　本研究旨在構(gòu)建一株能穩(wěn)定支持PPRV增殖的羊源永生化細(xì)胞系。首先，構(gòu)建了pLOV-puro-hTERT重組質(zhì)粒，然后利用慢病毒包裝系統(tǒng)，從293T細(xì)胞中拯救出重組慢病毒并感染原代綿羊肺成纖維細(xì)胞，在感染48h后，用嘌呤霉素連續(xù)加壓,篩選出具有抗性的存活細(xì)胞，將其擴(kuò)增并連續(xù)傳代至第10代，分別用分子生物

3、學(xué)和年醫(yī)學(xué)方法鑒定以后，最終獲得了永生化原代綿羊肺成纖維細(xì)胞系，并將其命名為SLT細(xì)胞系。遺憾的是，RT-PCR和WB結(jié)果顯示SLT細(xì)胞系可以支持PPRV的增殖，但是并沒有出現(xiàn)PPRV典型的細(xì)胞病變并且PPRV在SLT細(xì)胞上傳至第五代后也檢測(cè)不到PPRV的存在，同時(shí)表明SLT細(xì)胞系不能穩(wěn)定支持PPRV的增殖。
　　有研究表明山羊信號(hào)淋巴激活分子（Goat Signaling Lymphocyte Activation Molecu

4、le，gSLAM）是PPRV感染易感宿主細(xì)胞的一個(gè)重要的細(xì)胞受體之一。為了增加永生化細(xì)胞系（SLT細(xì)胞）對(duì)PPRV的敏感性，我們利用慢病毒包裝系統(tǒng)又構(gòu)建了穩(wěn)能定表達(dá)gSLAM的綿羊肺成纖維細(xì)胞系，命名為SLT-gSLAM細(xì)胞系。同時(shí)本研究制備了具有良好特異性的鼠抗gSLAM蛋白多克隆抗體，為SLT-gSLAM細(xì)胞系的鑒定工作提供了良好的基礎(chǔ)鑒定材。PPRV-Nigeria/75株接種SLT-gSLAM細(xì)胞并連續(xù)傳代3次后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞產(chǎn)生典