慢病毒介導(dǎo)shRNA穩(wěn)定持續(xù)抑制口蹄疫病毒增殖的兩類細(xì)胞系的建立.pdf

1、RNA干擾(RNAi)是廣泛存在于生物界的一種由內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA分子誘發(fā)的同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象,是許多生物具有的對抗入侵的核酸,保護(hù)自身的天然機(jī)制。誘發(fā)RNAi的最關(guān)鍵分子是長度為19～27bp的雙鏈RNA,被稱為小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)。隨著RNAi機(jī)制及其應(yīng)用研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)無論體內(nèi)還是體外試驗,siRNA均能夠抑制多種病毒的增殖。近年來,許多學(xué)者以人工誘導(dǎo)R

2、NAi的方式進(jìn)行了病毒復(fù)制的干擾研究,取得了良好進(jìn)展,因此RNAi技術(shù)被認(rèn)為是最有應(yīng)用價值的抗病毒感染方法之一。
　　 口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的多種偶蹄動物共患的急性傳染病,被國際獸疫局列為A類傳染病之首。由于口蹄疫病毒非常容易發(fā)生變異,導(dǎo)致新的變異株不斷出現(xiàn)、更迭,傳統(tǒng)的疫苗免疫等措施不能有效地應(yīng)對口蹄疫的爆發(fā)和流行。RNAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及其在抗病毒方面的研究進(jìn)展,為FMD的防制研究開辟了一個新的探索領(lǐng)域。本研究針對口蹄疫病毒

3、的體外復(fù)制進(jìn)行了RNA干擾的成功探索。FMDV的2B和3D基因在FMDV不同血清型和亞型中非常保守,根據(jù)美國Invitrogen公司提供的siRNA在線設(shè)計結(jié)果,針對2B和3D區(qū)段設(shè)計并合成了5個shRNA模板,同時設(shè)計了一個無關(guān)對照shRNA模板,分別克隆到shRNA表達(dá)載體的U6啟動子下游,構(gòu)建了6個相應(yīng)的shRNA表達(dá)質(zhì)粒。
　　 首先,從細(xì)胞水平研究了shRNA表達(dá)載體對3D基因表達(dá)的抑制作用,將3D基因克隆到真核表達(dá)載

4、體pEGFP-N1中,獲得重組的融合表達(dá)質(zhì)粒pEGFP+3D。將針對3D基因的4個干擾質(zhì)粒分別與pEGFP+3D共轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞,經(jīng)熒光顯微鏡觀察、流式細(xì)胞儀和real-time RT-PCR分析,表明pEN／U6-3D1、pEN／U6-3D2、pEN／U6-3D3和pEN／U6-3D4對3D基因的表達(dá)有一定的抑制作用,其中pEN／U6-3D2和pEN／U6-3D4的效果較為突出。
　　 然后將pEN／U6-3D2,pEN／

5、U6-3D4,pEN／U6-2B和pEN／U6-CON進(jìn)行LR重組生成對應(yīng)的pEX／U6-3D2,pEX／U6-3D4,pEX／U6-2B和pEX／U6-CON。接著將重組后的表達(dá)載體在轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)下和輔助質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,在轉(zhuǎn)染后50h時收獲慢病毒。將上述慢病毒轉(zhuǎn)染原代羊胚胎成纖維細(xì)胞和PK-15細(xì)胞,48h時換成帶有抗性的培養(yǎng)液進(jìn)行篩選,14天左右的時間獲得單克隆細(xì)胞株,擴(kuò)大培養(yǎng)后保存各細(xì)胞株,其中FMDV特異性shRNA