慢病毒介導的shRNA通過干擾microRNA表達譜非特異抑制丙型肝炎病毒增殖的研究.pdf

1、丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)感染引起的丙型病毒性肝炎及誘發(fā)的肝硬化、肝癌等疾病已嚴重威脅到人類健康，缺乏相應的疫苗和抗病毒藥物的局限性是控制HCV感染和治療相關疾病的主要障礙。HCV主要依賴于宿主因子完成病毒的入侵、復制、組裝和釋放，因此找出與HCV相互作用的宿主因子有助于闡明HCV的感染過程和宿主應答的分子機制，同時對發(fā)現(xiàn)新的抗病毒治療的藥物靶標和研制有效的HCV疫苗有著重要的理論和實際意義。
　　

2、HCV感染能誘導宿主細胞發(fā)生自噬，HCV復制的起始依賴于自噬相關蛋白，而且HCV誘導的自噬通過抑制宿主細胞天然免疫應答進而促進HCV的復制。但是HCV利用自噬進行自身復制的具體分子機制目前仍不清楚。本課題組在篩選與HCV誘導自噬相關的宿主因子時，發(fā)現(xiàn)荷電多囊體蛋白4B(charged multivesicularbody protein4B，CHMP4B)表達升高。CHMP4B作為轉運必需內涵體分選復合物-Ⅲ(endosomal sor

3、ting complex required for transport-Ⅲ，ESCRT-Ⅲ)的重要組成部分，參與細胞分裂，調節(jié)自噬，同時還參與HCV病毒顆粒的釋放。但是，CHMP4B調節(jié)自噬和影響HCV病毒顆粒釋放的具體分子機制不明。因此，本研究擬解決的第一個問題是:CHMP4B在HCV感染中發(fā)揮的作用是什么？本研究利用慢病毒介導的shRNA敲低CHMP4B，通過Westem Blot和Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)，瞬時敲低CHM

4、P4B導致宿主細胞內HCV蛋白水平下降而HCVRNA水平不變。為進一步研究CHMP4B通過與哪些宿主蛋白相互作用從而影響HCV蛋白表達，我們擬利用串聯(lián)親和純化（tandem affinity purification，TAP）技術篩選HCV感染時與CHMP4B相互作用的宿主蛋白。為此，我們利用慢病毒介導的shRNA構建了CHMP4B穩(wěn)定敲低的Huh7.5細胞系，擬通過外源表達與內源表達水平相當?shù)膸Ъ兓瘶撕灥腃HMP4B進行串聯(lián)親和純化以

5、獲得與CHMP4B相互作用蛋白。
　　然而，我們通過Western Blot和Real-time PCR發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定轉導CHMP4B shRNA和無靶標對照shRNA時Huh7.5細胞胞內HCV蛋白和RNA水平均明顯下降，而瞬時轉導無靶標對照shRNA胞內HCV蛋白和RNA水平無明顯變化，提示shRNA穩(wěn)定轉導可能誘導產生脫靶效應抑制HCV的增殖。因此，本研究針對shRNA穩(wěn)定轉導誘導的這種非特異性脫靶效應的機制進行了深入研究。為了

6、驗證脫靶效應是不是由于激活天然免疫應答所致，首先，我們通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測HCV感染后shRNA穩(wěn)定轉導細胞中IFN-β啟動子的活性，發(fā)現(xiàn)IFN-β啟動子活性無明顯變化，提示脫靶效應并非通過激活Ⅰ型干擾素通路誘導產生;其次，我們通過Real-time PCR方法檢測shRNA穩(wěn)定轉導細胞上清處理Huh7.5細胞后胞內HCVRNA的變化，發(fā)現(xiàn)胞內HCV RNA的含量無明顯變化，提示脫靶效應也不依賴于抗病毒因子的產生。瞬時轉導時shR

7、NA高水平表達會通過干擾宿主miRNA從而抑制HCV復制，提示shRNA的穩(wěn)定轉導可能也干擾miRNA的表達從而抑制HCV復制，因此本研究用miRNA芯片檢測了shRNA穩(wěn)定轉導細胞的miRNA表達譜。結果發(fā)現(xiàn)宿主細胞的miRNA表達譜發(fā)生顯著變化，提示脫靶效應的產生可能與miRNA表達譜的變化相關。對miRNA表達譜進一步分析表明，低水平的shRNA穩(wěn)定表達即可影響宿主miRNA的表達，進而影響HCV增殖。另外，shRNA整合位點也可

8、能影響miRNA表達譜的變化，進而影響HCV的增殖。miRNA表達譜中有60個miRNA表達水平有兩倍以上的變化，其中三個miRNA文獻已報道參與HCV感染的調控:miR-196a、miR-491和miR-149。為進一步驗證是不是miRNA表達譜的變化影響了HCV的增殖，除上述3個miRNA外，本研究還挑選了變化倍數(shù)較大且與上述miRNA變化趨勢一致的4個miRNA: miR-1246、miR-193、miR-744和miR-769，

9、通過Real-time PCR檢測轉染相應miRNA mimic和inhibitor后HCV增殖的情況。結果發(fā)現(xiàn)，過表達miR-196a或敲低miR-491均抑制HCV的增殖，與文獻報道一致，miR-149對HCV增殖無影響，也與文獻報道其參與調控HCV入侵一致;過表達miR-1246抑制HCV增殖，而miR-744、miR-193和miR-769對HCV增殖無影響。上述結果提示，慢病毒介導的shRNA通過干擾miRNA表達譜非特異性抑