干擾素誘導(dǎo)蛋白Viperin抑制丙型肝炎病毒復(fù)制機(jī)制的初步研究.pdf

1、丙型肝炎病毒(HCV)隸屬于黃病毒科丙型肝炎病毒屬,其基因組為單正鏈線狀的RNA。對(duì)于HCV的復(fù)制機(jī)制,一般認(rèn)為與其它黃病毒屬成員及單正鏈RNA病毒相似,即病毒進(jìn)入細(xì)胞并脫衣殼之后首先在胞漿或胞漿特定膜結(jié)構(gòu)內(nèi)翻譯產(chǎn)生病毒蛋白,這些病毒蛋白再通過與宿主細(xì)胞蛋白的相互作用對(duì)宿主的特定膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造,形成膜相關(guān)的復(fù)制復(fù)合體。α干擾素(IFN-α)是目前臨床使用的治療慢性丙型肝炎患者的有效藥物之一,與細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合后激活JAK-STAT級(jí)

2、聯(lián)信號(hào)放大系統(tǒng),通過與ISRE結(jié)合后引起相應(yīng)效應(yīng)蛋白的表達(dá)。目前已知,蛋白激酶R(PKR)、2’-5’寡腺苷酸合成酶(2’-5 OAS)、載脂蛋白BmRNA編輯酶催化多肽樣蛋白3G(APOBEC3G)等作用于病毒生活周期的不同階段,抑制了病毒的入胞、脫衣殼、翻譯、RNA的復(fù)制以及病毒粒子的包裝、成熟、釋放。盡管如此,對(duì)大多數(shù)干擾素誘導(dǎo)蛋白的抗病毒作用機(jī)制,目前仍不十分清楚。
　　 Viperin是一種由Ⅰ型和Ⅱ型干擾素誘導(dǎo)的,在

3、進(jìn)化上高度保守的干擾素誘導(dǎo)蛋白。2005年,Karla.Helbig等人首次報(bào)道在體外HCV亞基因組復(fù)制子(Replicon)系統(tǒng)中,Viperin可以抑制HCV病毒的復(fù)制,并且發(fā)現(xiàn)在所有檢測(cè)的慢性HCV感染病人的肝穿標(biāo)本中Viperin都呈現(xiàn)高水平表達(dá),提示Viperin在機(jī)體抑制HCV病毒感染中發(fā)揮重要作用。但對(duì)于Viperin的抑制HCV病毒復(fù)制的作用機(jī)制仍然了解較少,有待進(jìn)一步研究。
　　 為此,本研究首先對(duì)Viperi

4、n抑制HCV復(fù)制的效應(yīng)進(jìn)行了驗(yàn)證。通過在Replicon細(xì)胞中轉(zhuǎn)染不同劑量的Viperin,發(fā)現(xiàn)可以劑量依賴的方式下調(diào)內(nèi)源性HCV RNA及非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A的水平。接著,在感染性HCVcc系統(tǒng)中對(duì)這一現(xiàn)象進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證,對(duì)于Huh-7.5細(xì)胞,在用JFH-1病毒感染之前轉(zhuǎn)染表達(dá)Viperin,發(fā)現(xiàn)可以相類似的方式抑制細(xì)胞內(nèi)新生的HCV RNA和非結(jié)構(gòu)蛋白NS3的水平。進(jìn)一步利用免疫熒光分析技術(shù),觀察Viperin對(duì)內(nèi)源性HCV非結(jié)

5、構(gòu)蛋白NS5A的作用.通過在Replicon細(xì)胞中分析Viperin轉(zhuǎn)染之后NS5A陽性率,發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后30小時(shí),Viperin即可明顯下調(diào)NS5A的陽性率,60小時(shí)后下調(diào)作用更加明顯,當(dāng)在Replicon細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Viperin之后60小時(shí),很難觀察到Viperin和NS5A同時(shí)存在于同一個(gè)細(xì)胞.同時(shí)應(yīng)用Western blotting檢測(cè)NS5A的表達(dá)量,和這一現(xiàn)象相吻合,確認(rèn)Viperin對(duì)于Replicon細(xì)胞中NS5A下調(diào)作用

6、。
　　 最近,Viperin被證實(shí)可以通過和FPPS相互作用并抑制后者的酶活性,進(jìn)而破壞脂筏膜的正常結(jié)構(gòu),增加脂筏的流動(dòng)性,從而抑制流感病毒(Influenza virus)從胞漿膜上的釋放。如上所述,HCV病毒也在脂筏膜結(jié)構(gòu)上進(jìn)行RNA的復(fù)制,由此可以假設(shè)Viperin是否是通過同樣或者相類似的機(jī)制發(fā)揮其抑制HCV復(fù)制效應(yīng)。為此,對(duì)轉(zhuǎn)染Viperin的Replicon細(xì)胞進(jìn)行membrane flotation analys

7、is,探討HCV非結(jié)構(gòu)蛋白與脂筏的關(guān)聯(lián)程度是否受到影響。發(fā)現(xiàn)和轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染Viperin后,部分NS3和NS5A蛋白進(jìn)入到高密度區(qū)域,而用脂質(zhì)刪除試劑mβ CD處理時(shí),大部分HCV的非結(jié)構(gòu)蛋白NS3也都位于高密度區(qū)。該結(jié)果提示Viperin可能破壞了HCV的非結(jié)構(gòu)蛋白與脂筏膜的關(guān)聯(lián)程度。而對(duì)于Viperin的這種破壞作用,目前至少有兩種可能的解釋:一是Viperin直接作用于細(xì)胞內(nèi)脂閥膜結(jié)構(gòu),進(jìn)而干擾了同樣位于其上的HC

8、V復(fù)制復(fù)合體的穩(wěn)定性或者(和)組成；二是Viperin干擾了HCV復(fù)制復(fù)合體形成過程中的病毒蛋白與宿主蛋白之間的相互作用,進(jìn)而導(dǎo)致了HCV復(fù)制復(fù)合體形成的障礙。
　　 接下來對(duì)于兩種可能的機(jī)制進(jìn)行了分別的探討。對(duì)于第一種可能機(jī)制,首先探尋Viperin的這種效應(yīng)是否是特異性地針對(duì)HCV的非結(jié)構(gòu)蛋白,通過分析Viperin過量表達(dá)情況下,脂筏標(biāo)記分子Flotillin-2與脂筏膜的關(guān)聯(lián)程度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與HCV的非結(jié)構(gòu)蛋白相類似,Vi

9、perin的表達(dá)使得部分Flotillin-2進(jìn)入到高密度區(qū)。上述結(jié)果提示,Viperin的表達(dá)使得部分原先和脂筏相關(guān)聯(lián)的蛋白分子(包括HCV非結(jié)構(gòu)蛋白和脂筏標(biāo)記分子Flotillin-2)對(duì)非離子去污劑敏感而更容易從脂筏上脫落,這可能由Viperin引起脂筏膜結(jié)構(gòu)的改變或者破壞所造成。
　　 隨后,通過免疫熒光的方法分析了Viperin對(duì)于同樣位于脂筏上的HCV復(fù)制復(fù)合體的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組中hVAP33與內(nèi)源性的NS5

10、A存在細(xì)胞內(nèi)共定位相比,Viperin在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后,hVAP33從對(duì)照組的均勻核周分布變成聚集的點(diǎn)狀分布,并且和NS5A的共定位消失。
　　 最后,通過共轉(zhuǎn)不同比例的Viperin和FPPS的表達(dá)質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn)FPPS對(duì)于Viperin的抗HCV病毒活性存在著部分的回復(fù)作用,這就提示Viperin對(duì)于脂筏的破壞作用可能是通過抑制膽固醇的生物合成,進(jìn)而干擾了脂筏的正常微結(jié)構(gòu)或者功能實(shí)現(xiàn)的。
　　 對(duì)于第二種可能機(jī)制,首先通過

11、免疫熒光以及細(xì)胞內(nèi)免疫共沉實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)Viperin可以和宿主蛋白hVAP-33的Coiled-coil結(jié)構(gòu)域相互作用,提示了Viperin可能對(duì)病毒蛋白NS5A和hVAP-33之間的相互作用產(chǎn)生一定的影響。隨后利用細(xì)胞內(nèi)免疫共沉的方法,通過計(jì)算被沉淀的NS5A/NS5B的量與總的hVAP-33的量的比值,發(fā)現(xiàn)當(dāng)有Viperin表達(dá)時(shí),hVAP-33結(jié)合NS5A的效率約為對(duì)照組的40％,而同時(shí)hVAP-33結(jié)合NS5B的效率約為對(duì)照組的8

12、0％。這就提示了Viperin可能主要與HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合宿主蛋白hVAP-33。
　　 綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)Viperin一方面可能通過抑制脂筏的組成成分膽固醇的生物學(xué)合成,干擾細(xì)胞內(nèi)脂筏的正常微結(jié)構(gòu)或者功能,影響了位于其上的HCV的復(fù)制復(fù)合體的穩(wěn)定性或者組成,另一方面可能通過與HCV的NS5A蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合宿主蛋白hVAP-33從而影響了HCV復(fù)制復(fù)合體的形成,發(fā)揮了抑制HCV復(fù)制的效應(yīng)。上述發(fā)現(xiàn)對(duì)于Viperi