血漿miRNA表達(dá)譜與慢性乙肝炎干擾素療效和乙肝病病毒復(fù)制相關(guān)性的初步研究.pdf

1、由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染引起的乙型肝炎是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，它能進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化、肝細(xì)胞癌(HCC)而導(dǎo)致死亡。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界大約有3.5億乙肝感染者，其中每年大約有120萬(wàn)患者由于急性或慢性乙肝感染而死亡。2006年全國(guó)乙型肝炎流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)1-59歲一般人群HBsAg攜帶率為7.18％，幼齡感染者中90％可以發(fā)展為慢性肝炎，其中又有40％可以發(fā)展為肝硬化，而成人感染者中只有5％轉(zhuǎn)

2、為慢性乙肝，其中有5-20％會(huì)發(fā)展為肝硬化。
　　 干擾素α與核苷類似物，如拉米夫定、阿德福韋、恩替卡維、替比夫定等是HBV感染的主要治療藥物。由于干擾素療法具有療程較短(48周)，復(fù)發(fā)率較低，抗原轉(zhuǎn)換率較好的特點(diǎn)，在治療慢性乙肝方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)，聚乙二醇化干擾素(又稱長(zhǎng)效干擾素，主要有PEG-IFNα2a，PEG-IFNα2b兩種)由于體內(nèi)半衰期達(dá)一周，在慢乙肝患者中獲得了更高的e抗原血清轉(zhuǎn)換和表面抗原血清轉(zhuǎn)換(2.

3、9％，PEG-IFNα2a)。然而，長(zhǎng)效干擾素目前獲得的e抗原血清轉(zhuǎn)換率(PEG-IFNα2a32％，PEG-IFNα2b36％)、病毒核酸清除率仍遠(yuǎn)未令人滿意，此外治療容易引發(fā)如流感樣癥狀、抑郁、性格改變等副作用，嚴(yán)重影響病人生活質(zhì)量。因此，國(guó)內(nèi)外研究者一直在探索如何在治療前預(yù)測(cè)干擾素療效，如Buster等通過(guò)分析病人治療前臨床參數(shù)(如ALT，HBVDNA，基因型等)與療效的關(guān)系，制定了一個(gè)療效預(yù)測(cè)指數(shù)，然而其預(yù)測(cè)靈敏度與特異性仍遠(yuǎn)未

4、令人滿意。
　　 小非編碼RNA(約22個(gè)核苷酸)，又稱小RNA(microRNA，miRNA)是一類存在于各種組織中，廣泛參與多種生理與病理過(guò)程的小分子RNA。miRNAs通過(guò)與靶mRNA3’非翻譯末端核苷酸配對(duì)促進(jìn)其降解或抑制翻譯，參與了包括細(xì)胞發(fā)育、造血、凋亡和細(xì)胞增殖等幾乎所有生命活動(dòng)。已有研究發(fā)現(xiàn)miRNA在血液中能以游離狀態(tài)存在，并可作為肝臟損傷和腫瘤疾病非常敏感的分子標(biāo)記。
　　 為了探索慢性乙肝患者血漿m

5、iRNA表達(dá)譜與干擾素療效的關(guān)系，本研究對(duì)94例接受普通與長(zhǎng)效干擾素治療的慢乙肝患者治療前血漿抽提miRNA，進(jìn)行基因芯片檢測(cè)，其中66例歸入訓(xùn)練集，28例歸入測(cè)試集。根據(jù)miRNA與干擾素初期病毒學(xué)應(yīng)答(early virological response，EVR)的相關(guān)性，通過(guò)OneR特征值排名方法獲得最有預(yù)測(cè)意義的特征miRNA，通過(guò)支持向量機(jī)(Support VectorMachine，SVM)算法產(chǎn)生預(yù)測(cè)模型。為了獲得最高的準(zhǔn)

6、確率，通過(guò)IFS曲線(incremental feature selection)與去一法(leave-one-out)交叉驗(yàn)證方法優(yōu)化納入模型的特征miRNA數(shù)量。結(jié)果顯示，由11個(gè)miRNA(let-7a，miR-30a，miR-1290，miR-106b，miR-1224-5p，miR-939，miR-1281，miR-198，let-7f，miR-22和miR-638)組成的特征譜在訓(xùn)練集中獲得74.2％的總體準(zhǔn)確率，并在測(cè)試集

7、中獲得驗(yàn)證(準(zhǔn)確率71.4％)。單因素與多因素logistic回歸分析比較miRNA預(yù)測(cè)譜與相關(guān)臨床參數(shù)與療效的相關(guān)性顯示：miRNA譜是與療效相關(guān)的獨(dú)立因素(單因素回歸分析OR=7.35，p=2.12E-05，多因素回歸分析OR=6.62，p=2.00E-05)，而ALT水平只有較低的相關(guān)性(單因素回歸分析OR=1.47，p=0.002，多因素回歸分析OR=1.37，p=0.029)。將miRNA譜與ALT水平結(jié)合納入logistic

8、回歸模型，總體預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率可由73.4％提高到77.3％。
　　 為了評(píng)價(jià)血漿中miRNA水平與肝臟miRNA譜的關(guān)系，本研究進(jìn)一步對(duì)94例病例中13份肝組織FFPE(formalin fixed paraffin embedded，福爾馬林浸泡石蠟包埋)樣本的miRNA譜進(jìn)行基因芯片檢測(cè)。相關(guān)性分析顯示血漿miRNA譜與肝臟譜具有較高的相關(guān)性(單個(gè)病例相關(guān)性r=0.26-0.57 p=0.001-4.06×10-11，Pears

9、on相關(guān)檢驗(yàn)，11例總體相關(guān)性r=0.39，p<10-250)。如只考慮入選的11個(gè)miRNA，仍然能獲得較顯著的相關(guān)性(r=0.36，p=6.64×10-6)。這提示肝臟是血漿miRNA譜的主要來(lái)源，提示血漿miRNA譜可以間接反映肝miRNA的水平。
　　 鑒于上述工作發(fā)現(xiàn)血漿miRNA譜能用來(lái)預(yù)測(cè)慢乙肝患者干擾素治療的初期病毒學(xué)應(yīng)答，了解入選miRNA在乙肝病毒生活周期以及干擾素信號(hào)通路中的作用，本研究進(jìn)一步通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)評(píng)

10、價(jià)了11種miRNA與HBV復(fù)制的關(guān)系。將miRNA類似物(mimic)或抑制劑(inhibitor)與HBV復(fù)制型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，miR-939，miR-638與let-7f類似物能顯著抑制HBV抗原表達(dá)。Southern Blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)病毒核心顆粒DNA合成也受到抑制。將miRNA與HBV RNA穩(wěn)定性熒光素酶報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)，miR-939，miR-638與let-7f不能直接靶向HBV RNA序列。此外，

11、本研究還通過(guò)將miRNA與干擾素誘生、效應(yīng)通路報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這些miRNA并未顯著影響相關(guān)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-939，miR-638與let-7f，檢測(cè)細(xì)胞基因表達(dá)譜差異發(fā)現(xiàn)這三種miRNA能下調(diào)大量宿主基因，其中部分與腫瘤形成、炎癥因子信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)。
　　 綜上所述，本研究通過(guò)檢測(cè)慢性乙型肝炎患者血漿miRNA譜，利用生物信息學(xué)方法優(yōu)化獲得一個(gè)由11個(gè)miRNA組成的可預(yù)測(cè)干擾素初期干擾素應(yīng)答的模型，總體準(zhǔn)確