自噬現(xiàn)象與乙肝病毒復(fù)制的關(guān)系.pdf

1、[研究目的]
　　 通過研究自噬現(xiàn)象在乙肝病毒復(fù)制中所扮演的角色，尋找降低乙肝病毒復(fù)制的新途徑，并通過對其機制的研究，探討該現(xiàn)象對于宿主細胞生存的影響及其致癌性的可能機理。
　　 [研究方法]
　　 1．用HepG2.2.15細胞系和pUC1857-1HBV1.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HepG2細胞系構(gòu)建出有HBV復(fù)制的細胞系；
　　 2．采用3-甲基腺嘌呤和無胎牛血清培養(yǎng)基作為自噬現(xiàn)象的干預(yù)手段，使用HepG2細胞

2、系和pUC18質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HepG2細胞系作為對照，通過測量上清中HBV拷貝數(shù)評估HBV復(fù)制情況，并對細胞裂解液采用蛋白免疫印跡法(Western Blotting)對自噬水平進行分析；
　　 3．使用GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞及HBcAg免疫熒光抗體，通過熒光顯微鏡對HBV復(fù)制和自噬的水平進行評估；
　　 4．采用WST-1試劑及酶標儀測定，對細胞增殖狀態(tài)進行評估。
　　 [研究結(jié)果]
　　 1．Hep

3、G2.2.15細胞系和pUC1857-1HBV1.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HepG2細胞均有HBV產(chǎn)生和分泌。
　　 2．有HBV復(fù)制產(chǎn)生的細胞系—HepG2.2.15細胞系或pUC1857-1HBV1.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HepG2細胞中，P62蛋白水平的下降，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，說明HBV復(fù)制有誘導(dǎo)自噬的作用。
　　 3．在HepG2.2.15細胞系中，使用1mM濃度的自噬抑制劑3-MA，可以減少上清液中HBV的拷貝數(shù)。但是

4、對于1OmM濃度的3-MA，以及不含F(xiàn)BS的乏營養(yǎng)培養(yǎng)基對上清中HBV拷貝數(shù)的影響尚缺乏具有顯著性差異的結(jié)論。
　　 4．轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-LC3質(zhì)粒HepG2細胞中，GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中。而轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-LC3質(zhì)粒的HepG2.2.15細胞可以看到多個明亮的綠色熒光斑點。并且LC3斑點數(shù)量與HBcAg熒光斑點數(shù)量有一定程度的相關(guān)性，但兩者未表現(xiàn)出共定位。
　　 5．在無血清培養(yǎng)基的饑餓狀態(tài)下，

5、有HBV復(fù)制的細胞系增殖更快，加入1OmM的3-MA則會抑制這種增殖。提示HBV所上調(diào)的自噬有利于細胞在極端情況下的生存。
　　 [結(jié)論]
　　 乙肝病毒可以提高其宿主細胞中自噬的水平，但自噬對于乙肝病毒的復(fù)制、產(chǎn)生的意義以及具體的機制還有待于進一步探索。同時乙肝病毒也許有利于宿主細胞在應(yīng)激情境下生存狀態(tài)，但這種影響還需進一步的試驗驗證。更深入的研究也許將為我們治療乙肝病毒感染，阻止或減緩慢性乙肝病毒感染向肝硬化、肝癌進