乙肝病毒基因型和病毒變異與肝細胞癌的關系研究.pdf

1、臨床流行病學和病毒學研究表明，在我國，乙型肝炎病毒(HBV)感染是肝細胞癌(HCC)最重要的病因，HBV復制在肝炎、肝硬化、肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程中、甚至肝癌轉移和復發(fā)階段都可能起重要的作用，然而，HBV致HCC的確切機制目前還沒有明確。根據HBV全基因序列異質性≥8％的標準，將HBV分為A-H八個基因型，研究發(fā)現我國主要的基因型是B型與C型，并發(fā)現基因型與病毒變異有一定的依從性，尤其是核心啟動子(BCP)變異和前C終止密碼子變異(PC)

2、。最近許多研究表明HBV基因型、病毒變異、HBV DNA水平與HCC存在一定的關系，然而還沒有統(tǒng)一的觀點，甚至出現相反的結論。 為進一步研究HBV基因型及病毒變異與HCC發(fā)生的確切關系，我們利用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)以及部分PCR產物測序的方法對401例慢性HBV感染者，包括112例HCC患者(HCC組)，129例無癥狀攜帶者(ASC組)，70例肝硬化患者(LC組)和90例慢性肝炎患者(CH組)

3、進行HBV基因分型和C基因亞型鑒定，以及BCP和PC變異檢測。結果發(fā)現401例慢性HBV感染者HBV基因型為B基因型或C基因型感染，未發(fā)現其他基因型，HCC組中C型分布高于其他三個疾病組；在HCC病例組中血清纖維化指標的多因素分析提示前膠原Ⅲ肽(PⅢP)水平在C基因型中高于B基因型。對基因型與HBV變異和臨床特點作了相關性分析，發(fā)現C基因型患者BCP變異多于B基因型；B基因型患者PC變異多于C基因型；同時BCP變異發(fā)生率隨著病程進展而遞

4、增：在HCC組、LC組、CH組和ASC組里的BCP變異陽性率分別為74.1％，50.0％，35.0％，22.4％。對270例患者(HCC 112例，LC 70例，CH 90例)進行HBV亞型鑒定，發(fā)現C1有105例(67.7％)，C2有50例(32.3％)，顯示C1在本研究對象中的分布高于C2；對亞型與HBV BCP、PC變異的比較，發(fā)現C1亞型帶有較高的BCP變異。 因此本章研究結果提示HBV C基因型和BCP變異是HCC發(fā)生

5、的密切相關因素。近年來，雖然肝癌治療措施尤其是肝葉切除術已有很大的改進和提高，但肝癌的長期預后仍不佳，其重要的原因是腫瘤的復發(fā)或轉移率高。據有關資料統(tǒng)計，5年左右肝細胞癌復發(fā)超過70％，目前對引起肝癌復發(fā)和轉移的多種臨床危險因素已有一些研究，包括腫瘤本身的相關因素和肝臟功能情況。包括腫瘤大小、是否存在包膜、瘤體本身的血管侵潤情況，肝臟功能以及肝葉切除的方式等都會影響肝癌復發(fā)和轉移的發(fā)生率。然而越來越多的證據提示HBV基因型與HCC的發(fā)生

6、發(fā)展有密切關系并影響著HBV相關性肝病的臨床表現和臨床結局，在HBV的8個基因型中，東南亞地區(qū)主要以B型和C型為主，最近的研究資料以及前面的研究已經證實C基因型較B基因型有較高的HCC發(fā)生率和引起更為嚴重的肝細胞損害，是促進HCC發(fā)生的高危因素，然而，HBV基因型與病毒載量對肝細胞癌的預后影響尚未得到深入研究，因此我們繼續(xù)對前一部分研究對象中112例HCC患者進行追蹤觀察，探討HCC治療后腫瘤復發(fā)或轉移的危險因素。在明確HBV基因型、病

7、毒變異的基礎上，采用實時熒光定量檢測試劑盒進行HlBV DNA定量測定，結果顯示最終進入隨訪研究的106例HCC患者(在隨訪過程中6例患者由于以下原因而列出研究范圍：4例患者在隨訪52周后觀察資料缺失；2例沒有完整的病理資料，因此共106例患者進入最終的前瞻性研究)有69例在手術后或肝動脈栓塞化療術(TACE)治療后兩年內出現腫瘤的復發(fā)或轉移，其發(fā)生率隨著時間的推移而逐漸上升，在20周、40周、60周、80周、100周和130周分別為3

8、.8％，9.4％，18.9％，42.5％，59.4％和65.1％。對基線資料的單因素分析，發(fā)現血清高水平GGT、無包膜瘤體、門靜脈栓塞形成、較大肝癌、肝硬化、BCP變異、C基因型、HBV DNA水平均與肝細胞癌的高復發(fā)率或轉移率有關，而年齡、性別、谷丙轉氨酶水平、血小板計數、血清白蛋白水平、甲胎蛋白、總膽紅素、Child-Pugh分數和治療手段與肝細胞癌的復發(fā)或轉移無關。 多因素分析顯示HBV C基因型和HBV DNA高水平是H

9、BV相關性HCC復發(fā)和轉移的危險因素。復發(fā)或轉移率隨著HBV DNA水平的上升而增加，在基線HBV DNA水平小于3 loglo拷貝/mL的肝細胞癌患者中，腫瘤的復發(fā)或轉移率為22％，在基線HBV DNA水平大于5 loglo拷貝/ml的肝細胞癌患者中，腫瘤的復發(fā)或轉移率升為80％；在106例HCC患者中B基因型29例，C基因型77例；其中77例C基因型有57例(74.0％)發(fā)生腫瘤的復發(fā)或轉移，29例B基因型有12例(41.4％)發(fā)生

10、腫瘤的復發(fā)或轉移，通過Logistic回歸分析，發(fā)現基因型C較B基因型有更高的肝癌復發(fā)或轉移發(fā)生率。因此，HBV C基因型和HBV DNA高水平是HBV相關性HCC復發(fā)和轉移的危險因素，同時對HBV C基因型與HBV DNA的相關性分析顯示這兩個危險因素之間沒有關聯(lián)，進一步表明HBV C基因型和HBV DNA水平分別是HCC復發(fā)和轉移的相互獨立的危險因素。提示HBV C基因型不僅與HCC的發(fā)生有密切關系，同時也影響著腫瘤的復發(fā)和轉移，因

11、此臨床上需要對慢性HBV感染者進行HBV基因型鑒定，以更準確地預測慢性HBV感染的臨床結局和評估HCC患者的預后。血清高水平HBV DNA是HBV相關性HCC復發(fā)或轉移的獨立危險因素，提示抗病毒治療不僅應用于慢性肝炎患者，對HBV相關性肝細胞癌術后進行抗病毒治療也是非常必要的。在前面兩部分的研究中，我們通過401例慢性HBV感染者(包括肝細胞癌患者、肝硬化患者、慢性肝炎患者、無癥狀攜帶者)分析了HBV基因型、亞型、病毒變異的情況，發(fā)現了

12、HBV C基因型和BCP變異與肝細胞癌的發(fā)生與發(fā)展有密切關系，C基因型和HBV DNA水平可影響HCC的預后和腫瘤轉歸，是肝細胞癌變的重要危險因素。由于HBx基因序列覆蓋了BCP區(qū)域，BCP區(qū)的T1762/A1764核苷酸雙突變導致X蛋白的第130和131位氨基酸發(fā)生改變，同時HBx可通過與細胞因子或蛋白結合而發(fā)揮其肝癌變作用，因此，探討HBx基因對細胞周期蛋白的調控機理為揭示HBV致肝細胞癌變機制提供理論和實驗依據。 我們通過

13、構建HBV-X基因BCP陽性真核表達載體(HBV-X-BCP<'+>)和HBV-X基因BCP陰性真核表達載體(HBV-X-BCP<'->)，瞬時轉染HepG2細胞，Western Blotting鑒定HBx融合蛋白和p21<'WAFI/CIPI>蛋白的表達，觀察BCP變異引起的X蛋白兩個氨基酸的變化是否會影響細胞周期蛋白p21<'WAFI/CIPI>的表達情況，從而明確BCP變異致HCC的發(fā)生機制。實驗結果顯示BCP變異陰性的野生型HB

14、x基因能促進p21<'WAFI/CIPI>蛋白的表達，而BCP陽性的變異型HBx基因卻下調p21<'WAFI/CIPI>蛋白的表達，提示HBVX基因致肝細胞癌變的重要機制是由于長期的病毒感染導致HBV BCP變異，使HBx基因的兩個氨基酸發(fā)生變化，致使細胞周期蛋白p21<'WAFI/CIPI>表達下降，異常細胞迅速增生，受損細胞順利通過G0-G1期進入DNA合成分裂階段，細胞對癌基因敏感性增強，異常細胞在無控制的情況下增長，極易出現幼稚