肝細胞癌中的乙肝病毒基因整合規(guī)律及其促癌作用研究.pdf

1、研究背景:
　　乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）慢性感染導致的肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是中國最重要的死亡原因之一。體細胞變異是HCC進化的基礎，而HBV基因整合是HBV-HCC特有的突變類型，也是HBV直接損傷人體基因組的方式。大量研究發(fā)現(xiàn)HBV整合事件在HCC基因組中積累，提示這類突變可以賦予變異細胞生存優(yōu)勢，進而促進癌癥發(fā)生。目前該領域的研究存在以下局限性:

2、首先，關于HBV整合的研究都局限在基因組水平，缺乏轉錄組水平的研究。基因組水平的HBV整合突變影響基因轉錄的方式和程度尚不明確;前基因組RNA的合成與逆轉錄是HBV復制的關鍵步驟，目前不能確定在相關過程中病毒RNA是否可以直接整合到人體RNA鏈。其次，個體間的HBV突變譜差異較大，阻礙了HBV整合突變的有效檢測和全面分析。第三，目前僅有TERT和MLL4基因被證實為常見的HBV整合基因，上述2種基因中的HBV整合突變僅占此類突變總量的2

3、％以下;其余大量HBV整合突變的促癌功能尚待研究。最后，HBV整合的發(fā)生機制也不明確。載脂蛋白BmRNA編輯多肽3家族(apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide3，APOBECE3)是誘導體細胞突變和病毒突變產(chǎn)生的重要分子，可以誘導人體和病毒核酸鏈斷裂，但是尚無研究闡明APOBEC3對HBV整合的作用。HBV-HCC的發(fā)生發(fā)展是遺傳、免疫和病毒因素共同作用的進化

4、過程。研究APOBEC3的單核甘酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）在病毒突變和癌癥發(fā)生中的作用對明確HBV致癌過程有重要意義。
　　研究目的:
　　明確HBV整合在基因組和轉錄組水平的分布規(guī)律;研究HBV整合的發(fā)生機制以及這類突變在肝細胞癌進化過程中的作用;闡明APOBEC3致突變基因與HBV整合的關系;分析APOBEC3遺傳多態(tài)性與病毒清除、病毒突變和HCC風險的相關性;為HB

5、V感染者的癌癥防治提供新靶點。
　　研究方法:
　　應用50例HCC患者的癌和癌旁組織進行HBV-捕獲測序以及RNA測序。以HBV各基因型的標準序列為基礎，利用患者體內(nèi)的HBV突變信息進行校正，生成每個患者個體化的病毒參考序列。將測序片段與人核基因組、線粒體基因組以及病毒基因組參考序列進行比對，確定HBV整合突變。隨機挑選80個DNA和RNA水平的整合位點，以巢式PCR和Sanger測序的方法進行驗證。分別利用標準化配對測序

6、片段數(shù)(support PE-assembled reads，NNSS)和嵌合測序片段數(shù)(reads)評價DNA和RNA水平的整合突變信號強度。在DNA水平，NNSS≥1的HBV整合突變納入分析;在RNA水平，reads≥2的HBV整合突變納入分析。以x2檢驗分析HBV整合突變在人基因組、病毒基因組以及人群間的分布特征。為排除低頻隨機整合的影響，以HBV整合突變信號強度的上四分位點為界值，篩選高強度的整合突變，重復驗證HBV整合突變分布

7、規(guī)律。采用Wilcoxon非參數(shù)秩和檢驗分析HBV整合突變的數(shù)量差異;以t檢驗或方差分析評價基因表達水平的差異;以Pearson相關性檢驗分析APOBEC3表達與HBV整合突變的相關性;以Log-Rank檢驗評價HBV整合突變對HCC患者預后及復發(fā)的影響;以KEGG和GSEA分析確定HBV整合突變顯著影響的信號通路和生物功能。P＜0.05則判定差異具有統(tǒng)計學意義。下載HCC人群的高通量測序和表達譜公共數(shù)據(jù)庫，包括HBV捕獲測序數(shù)據(jù)庫（S

8、RP068532，426例樣本）、癌癥基因組聯(lián)盟(The Cancer Genome Atlas，TCGA)的HCC隨訪隊列數(shù)據(jù)庫(LIHC，366例)以及基因表達數(shù)據(jù)集(Gene Expression Omnibus，GEO)的HCC表達譜數(shù)據(jù)庫（GSE14520，242例）。利用上述數(shù)據(jù)庫對本研究發(fā)現(xiàn)的HBV整合突變規(guī)律及功能進行驗證。挑選APOBEC3A、APOBEC3B、以及DNA修復基因UNG的4個SNP位點進行研究。使用熒光

9、定量PCR的方法對1449例健康對照和3772例HBV感染者（包括1271例HCC患者）進行SNP分型，使用巢式PCR擴增病毒preS和BCP區(qū)片段，使用MEGA軟件分析病毒突變。用logistic回歸計算SNP基因型與病毒清除、病毒突變以及HCC風險的相關性。
　　研究結果:
　　1.DNA和RNA水平的HBV整合規(guī)律有顯著差異
　　以HBV突變信息校正參考序列，可以提高HBV整合事件的檢出率。本研究在基因組和轉錄組

10、水平分別檢測到HBV整合突變2777個和2918個。在DNA水平，癌癥組織中的HBV整合數(shù)量顯著高于癌旁組織(P=1.0×10-4);HCC術后未復發(fā)人群→HCC術后晚期復發(fā)人群（大于2年）→HCC術后早期復發(fā)人群（小于等于2年）的癌癥組織中，HBV整合突變數(shù)量逐漸升高。在RNA水平，癌癥組織中的HBV整合數(shù)量顯著少于癌旁組織(P=1.2×10-3);各HCC進化階段的人群之間，HBV整合突變數(shù)量沒有顯著差別。DNA水平的HBV整合突變

11、僅有0.5％分布在線粒體基因組，而RNA水平的HBV整合突變則有19.43％分布在線粒體基因組。這一差別在驗證隊列中得到重復。
　　2、HBV X片段是整合入人體基因組的主要片段
　　HBV X區(qū)(nt1374-nt1835)的整合事件數(shù)在DNA水平、RNA線粒體基因組水平以及RNA核基因組水平的比例分別為31.6％，35.1％，以及58.0％，顯著高于隨機整合率(14％)。在高信號強度的HBV整合突變中，HBV X片段的比

12、例更高。
　　3、HBV高頻整合基因
　　在DNA水平，292個基因在≥2個樣本中均檢測到HBV整合突變，定義為重復整合基因;其中僅有11個(3％)在RNA水平也被鑒定為重復整合基因;只有2個(MLL4和TERT，0.6％)可以在同一樣本的DNA和RNA數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)高度一致的HBV整合突變。在DNA水平，TERT的HBV整合突變檢出率最高(16％)，全部分布在啟動子區(qū)。在RNA水平，ALB的HBV整合檢出率最高(51％);同時

13、，全部13個線粒體編碼基因均發(fā)生了HBV整合突變，而且重復檢出率均在13.2％-43％。
　　4、HBV整合與基因表達的相關性
　　在DNA水平，TERT啟動子區(qū)的HBV整合與TERT基因在癌癥組織中的表達升高有關(P=3.89×10-8);同時TERT上游3kb區(qū)域中HBV X片段的反向插入也有促進TERT表達的趨勢;MLL4、MT-ND4等重復整合基因的表達水平與HBV在DNA鏈的整合無關。在RNA水平，MLL4、ALB

14、、HP、MT-CO2和MT-CYB上的HBV整合突變與基因表達水平升高有顯著相關性。
　　5、HBV整合突變相關的信號通路
　　DNA水平的整合突變顯著富集于PI3K-mTOR通路和染色質重塑通路，通路整體整合突變率分別為30％和20％。RNA水平的整合突變顯著富集于IL2-STAT5和IL6-STAT3等炎癥通路。
　　6、HBV整合對HCC預后的影響
　　癌旁組織中DNA水平的HBV整合總數(shù)過高預示早期復發(fā)(

15、P=0.012)，該作用在驗證隊列中得到重復(P=0.014)。RNA水平上，癌旁組織中核基因組以及線粒體基因組上的整合突變總數(shù)過高，均可以預示HCC患者整體生存預后不良(P=0.027，0.033)。
　　研究結論:
　　1、HBV整合突變的分布規(guī)律在DNA和RNA水平存在顯著差異，絕大多數(shù)RNA水平的HBV整合突變不是由DNA的整合突變轉錄而來，而是在RNA鏈上直接插入病毒片段導致。
　　2、RNA水平的HBV整合

16、顯著影響線粒體有氧氧化呼吸鏈的相關基因，DNA水平的HBV整合基因顯著富集致癌通路;基因組和轉錄組水平的HBV整合事件數(shù)量過高均與預后不良有顯著相關性，初步明確了HBV整合的促癌作用。
　　3、發(fā)現(xiàn)RNA水平整合突變的發(fā)生與致突變基因APOBEC3A、APOBEC3B的表達呈正相關，同時也與體內(nèi)炎癥免疫通路密切相關;初步證明炎癥通路刺激下誘變分子表達升高可以促進HBV整合突變的產(chǎn)生。
　　4、APOBEC3A、APOBEC3