RNA干擾沉默乙肝病毒X基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)性治療肝細(xì)胞癌的研究.pdf

1、中南大學(xué)博士學(xué)位論文RNA干擾沉默乙肝病毒X基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)性治療肝細(xì)胞癌的研究姓名：王文龍申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：內(nèi)科學(xué)指導(dǎo)教師：楊旭20080601博士學(xué)位論文英文摘要細(xì)胞，觀察EGFP表達(dá)，流式細(xì)胞分析轉(zhuǎn)染效率。電穿孔轉(zhuǎn)染將三種構(gòu)建的質(zhì)粒導(dǎo)入MHCC97H細(xì)胞；G418篩選、挑單細(xì)胞克?。挥冒攵縍TPCR及細(xì)胞免疫熒光分析單細(xì)胞克隆中靶[句shRNA對(duì)HBx基因mRNA及細(xì)胞內(nèi)船x蛋白水平的影響。對(duì)HBx表達(dá)下調(diào)的單細(xì)胞克隆，體外實(shí)

2、驗(yàn)分析細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖；裸鼠體內(nèi)單細(xì)胞克隆成瘤情況：并對(duì)成瘤組織行病理分析。結(jié)果：在MHCC97一H細(xì)胞中克隆、測(cè)序獲247bpHBx基因片段，Blast分析證實(shí)整合的HBx基因?yàn)閍dr亞型(C基因型)；HBx全基因擴(kuò)增失敗，推測(cè)船VDNA整合位點(diǎn)可能位于HBx基因3’末端，導(dǎo)致整合HBx基因3’末端缺失；MHCC97一H細(xì)胞整合HBx基因轉(zhuǎn)錄mRNA并表達(dá)HBx蛋白。酶切、PCR及測(cè)序證實(shí)pshRNAX164／X215／MOCK載體

3、構(gòu)建成功；轉(zhuǎn)染48h后MHCC97H細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，pshRNhX215轉(zhuǎn)染效率最低。經(jīng)過(guò)30一35天篩選，pshRNAX215／X164／MOCK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后分別挑取了109個(gè)、184、60個(gè)單細(xì)胞克?。话攵縍TPCR分析：與姍ICC97H比較，MOCK各單細(xì)胞克隆HBxmRNA水平變化不明顯；與MOCK02克隆比較，X215有6個(gè)克隆有HBxmRNA水平的下調(diào)約為70—93％，X164各克隆下調(diào)≤25％；與MOCK02克隆比較，2