乙肝病毒X基因?qū)epG2細胞凋亡的影響.pdf

1、目的: 探討HBX基因?qū)θ烁伟┘毎鸋epG2凋亡及凋亡相關基因表達的影響。 方法: 用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將HBX基因真核表達載體pcDNA3.1-X轉(zhuǎn)入人肝癌細胞HepG2中，建立瞬時轉(zhuǎn)染細胞模型(HepG2/HBXT)；G418篩選陽性克隆，反復傳代，并且至少凍存1次，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞模型(HepG2/HBXs)。通過RT-PCR、免疫熒光和免疫印跡檢測鑒定HBX基因在瞬時轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中的表達。以轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1的H

2、epG2(HepG2/pcDNA3.1)細胞和未轉(zhuǎn)染的HepG2細胞為對照，取瞬時轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h、96h細胞及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞，作以下處理：行流式細胞術分析肝細胞凋亡率的變化；分別取細胞標本抽提RNA并以β-actin為內(nèi)參，半定量RT-PCR法檢測HBX mRNA和凋亡相關基因Fas mRNA、BaxmRNA、Bcl-2 mRNA表達量的變化。 結果: (1)瞬時轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染均成功地將HBX基因轉(zhuǎn)至HepG2細胞中

3、，經(jīng)RT-PCR、免疫熒光和免疫印跡法證實了瞬時轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中均有HBX基因的表達。(2)瞬時轉(zhuǎn)染后于24h、48h、72h、96h，HepG2/HBXT與HepG2/pcDNA3.1T細胞相比，細胞凋亡率、Fas mRNA表達量、Bax mRNA表達量均增高，而Bcl-2 mRNA表達量均減少，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；HepG2/HBXT與HepG2細胞相比，細胞凋亡率、Fas mRNA表達量、Bax mRNA 表達

4、量均增高，而Bcl-2 mRNA表達量均減少，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；HepG2/pcDNA3.1T與HepG2細胞相比，細胞凋亡率、Fas mRNA表達量、Bax mRNA表達量及Bcl-2 mRNA表達量差別均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(3)瞬時轉(zhuǎn)染時HepG2/HBXT細胞HBX mRNA表達量隨時間延長而逐漸增高(P<0.05)，其細胞凋亡率、Fas mRNA表達量、Bax mRNA表達量也均逐漸增高(P<0.0

5、5)，且HBX mRNA表達量與細胞凋亡率、Fas mRNA表達量、Bax mRNA表達量均呈正相關(P<0.05)；Bcl-2 mRNA表達量隨時間延長逐漸減少(P<0.05)，且HBXmRNA表達量與Bcl-2 mRNA表達量呈負相關(P<0.05)。(4)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時，HepG2/HBXs與HepG2/pcDNA3.1s及HepG2細胞兩兩相比，細胞凋亡率、FasmRNA表達量、Bax mRNA表達量差別均無統(tǒng)計學意義(P>0.05

6、)；而HepG2/HBXs細胞中Bcl-2 mRNA表達量較HepG2/pcDNA3.1s及HepG2細胞均增高，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；HepG2/pcDNA3.1s與HepG2細胞相比，Bel-2 mRNA表達量差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 結論: (1)本實驗成功建立了瞬時及穩(wěn)定表達HBX的HepG2/HBX細胞模型。(2)瞬時轉(zhuǎn)染時HBX基因可通過上調(diào)Fas、Bax，下調(diào)Bcl-2的表達，促進HepG2