乙肝病毒X蛋白激活MLK3-MKK7-JNK信號模塊及Fas-FasL 信號通路誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡.pdf

1、目的: 探討乙肝病毒X蛋白能否激活MLK3-MKK7-JNK信號模塊，從而活化Fas/FasL死亡受體信號通路誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡。
　　 方法: 采用分子生物學(xué)的方法構(gòu)建靶向HBX的shRNA表達(dá)載體pSilencer3.1-shHBX，通過雙酶切鑒定后，選出陽性克隆進(jìn)行DNA測序。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將HBx的表達(dá)載體pcDNA3.1-X轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞建立HBX的高表達(dá)模型（pcDNA3.1-X組），將pSilencer3

2、.1-shHBX與pcDNA3.1-X按3：1共轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞建立干擾HBX表達(dá)的細(xì)胞模型（RNAi組），同時(shí)設(shè)立只轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞對照（HepG2組）和以通用陰性對照質(zhì)粒代替pSilencer3.1-shHBX的陰性對照（陰性對照組）。轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，分別以RT-PCR、Western blot和細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測HBX的表達(dá)量。流式細(xì)胞儀、Tunel染色和Hochest33258染色檢測細(xì)胞的凋亡

3、情況。同時(shí)采用Western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測MLK3-MKK7-JNK信號模塊及Fas-L, Bax，p-Bcl-2蛋白的表達(dá)情況，分光光度法檢測caspase3，caspase8的活性。
　　 結(jié)果:
　　 1、重組干擾質(zhì)粒即表達(dá)載體pSilencer3.1-shHBX測序鑒定結(jié)果與質(zhì)粒的設(shè)計(jì)序列一致。
　　 2、與HepG2細(xì)胞組相比，在pcDNA3.1-X 轉(zhuǎn)染組和陰性對照組中，Western

4、blot檢測顯示MLK3、MKK7、JNKs磷酸化水平明顯增加（P<0.05），F(xiàn)as-L蛋白相對表達(dá)量亦增加（P<0.05）；而在RNAi模型中上述蛋白指標(biāo)均降低，與pcDNA3.1-X 轉(zhuǎn)染組和陰性對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 3、分光光度法檢測結(jié)果顯示，與HepG2細(xì)胞組相比，在pcDNA3.1-X 轉(zhuǎn)染組和陰性對照組中， caspase8 ， caspase3 酶活性增強(qiáng)（ P<0.05 ）；而

5、在RNAi 模型中，caspase8，caspase3酶活性減弱，且與pcDNA3.1-X 轉(zhuǎn)染組和陰性對照相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 4、經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測結(jié)果顯示HepG2細(xì)胞凋亡率在pcDNA3.1-X 轉(zhuǎn)染組中較HepG2細(xì)胞組顯著增加（P<0.05）；而在RNAi模型中，細(xì)胞凋亡率下降，且與pcDNA3.1-X 轉(zhuǎn)染組和陰性對照組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 結(jié)論