壯肝逐瘀煎對肝纖維化大鼠肝星狀細(xì)胞Fas-FasL凋亡信號通路的影響.pdf

1、目的:本課題主要以研究壯肝逐瘀煎對肝纖維化大鼠 Fas、FasL因子信號調(diào)節(jié)誘導(dǎo)活化肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate Cells,HSCs)凋亡的角度出發(fā),進一步探討壯肝逐瘀煎抗肝纖維化(Hepatic Fibrosis, HF)的作用機制。
　　方法:選取102只體重220-250g雌雄各半的清潔級SD大鼠作為實驗對象。任意取其中18只作為正常對照組(A組)進行正常喂養(yǎng),其余大鼠按韓德五法采用CCL4復(fù)合因素進行HF

2、造模:在以單純玉米面及0.5％膽固醇混合而成的高脂低蛋白食物為主食(實驗第1、2周還需加入20％花生油),30％酒精為唯一液體補充的飲食誘導(dǎo)基礎(chǔ)上,配合皮下注射肝毒劑40％CCL4(第1次以5ml/Kg體重注入,之后每隔3天以3ml/kg體重注入)。實驗第4周末,隨機于 A組及造模組大鼠中各取4只進行HF相關(guān)檢驗。在結(jié)果提示HF形成證實造模成功后,將大鼠平均分為病理模型組(B組),壯肝逐瘀煎大劑量組(C組)、壯肝逐瘀煎中劑量組(D組)、

3、壯肝逐瘀煎小劑量組(E組)、秋水仙堿(F組)及大黃蟅蟲丸組(G組),共6組,每組14只。為防止肝臟自然修復(fù)對實驗結(jié)果造成不必要的影響,造模成功后仍繼續(xù)對大鼠予皮下注射肝毒劑40％CCL4(每周以3ml/kg體重注入)。實驗第5周始,A組除按正常飲食外,加以同容積的生理鹽水灌胃處理;B組以同容積的生理鹽水灌胃處理;C、D、E組以壯肝逐瘀煎灌胃處理,劑量分別為10g/Kg體重、5g/Kg體重、2.5g/Kg體重;F組以秋水仙堿灌胃處理,劑量

4、為100μg/Kg體重;G組以大黃蟅蟲丸灌胃處理,劑量為1.5g/Kg體重(灌胃液體量為0.1ml/Kg體重,1次/天,藥物濃度及等效劑量按體表面積折算),共給藥6周。實驗第10周末,所有大鼠在完成最后一次灌胃后禁食12小時,使用1％戊巴比妥鈉皮下麻醉,經(jīng)股靜脈采血后將其處死,立即剖取肝臟,在每片肝右葉的大致相同部位取少量肝組織以備作常規(guī)石蠟切片,存置于10％福爾馬林液中,其余肝臟以備檢測蛋白而存置于液氮中。觀察實驗大鼠的主要癥狀及體征

5、;肝臟大體形態(tài)改變情況;免疫組化法對Fas組織分布進行定性分析;酶聯(lián)吸附免疫染色法(Elisa)對血清及肝組織中Fas、FasL進行濃度水平檢測;實時定量 PCR法(Realtime-PCR)對肝組織FasmRNA、FasLmRNA水平進行檢測。
　　結(jié)果:(1)免疫組化結(jié)果顯示,壯肝逐瘀煎大劑量組呈強陽性表達,較正常對照組、病理模型組、壯肝逐瘀煎中、小劑量組、秋水仙堿組及大黃蜇蟲丸組表達明顯增強。(2)酶聯(lián)免疫吸附染色法結(jié)果顯示

6、,隨著實驗時間的延長,與病理模型組相比,壯肝逐瘀煎治療組及秋水仙堿組均能明顯增加大鼠血清及肝臟中HSCs內(nèi)Fas、FasL的表達(P<0.01),其中以壯肝逐瘀煎大劑量組升高最顯著(P<0.01);實驗48h壯肝逐瘀煎大劑量組肝臟中HSCs內(nèi)Fas、FasL的表達較實驗24h壯肝逐瘀煎大劑量組明顯升高(P<0.01)。(3)Realtime-PCR結(jié)果顯示,與病理模型組相比,壯肝逐瘀煎各治療組、秋水仙堿組及大黃蟄蟲丸組均能明顯下調(diào)大鼠肝