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文檔簡(jiǎn)介
1、[研究目的]
建立穩(wěn)定可靠的大鼠肝纖維化動(dòng)物模型,觀察經(jīng)淫羊藿素灌胃給藥后大鼠肝功能指標(biāo)的改變及肝組織中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA)表達(dá)的變化,并在此基礎(chǔ)上分離培養(yǎng)大鼠原代肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cells,HSCs),探討淫羊藿素對(duì)原代HSCs 活化的抑制作用。
[研究方法]
體內(nèi)實(shí)驗(yàn):通過膽管結(jié)扎(Bile duct li
2、gation,BDL)和四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的方法,分別建立膽汁淤積性和化學(xué)損傷性大鼠肝纖維化動(dòng)物模型。在肝纖維化形成后,給予大鼠灌胃淫羊藿素治療,給藥劑量為1mg/kg 體重,治療時(shí)間為3次/周,共持續(xù)4周。治療完成后,從大鼠股動(dòng)脈取血檢測(cè)肝功能指標(biāo)的變化,取肝組織行病理切片,通過HE 染色觀察大鼠肝臟損傷情況,通過免疫組化染色半定量分析肝組織內(nèi)α-SMA染色陽(yáng)性的活化型HSCs的分布和表達(dá)程度,分析淫羊藿素對(duì)由膽汁淤積和化學(xué)損傷
3、引起的大鼠肝纖維化的緩解作用。數(shù)據(jù)通過統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0進(jìn)行處理,結(jié)果以x_±s.d.表示,組間均數(shù)差異比較采用方差分析(One-way ANOVA)檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
體外實(shí)驗(yàn):通過膠原酶原位灌注消化,Nycodenz 密度梯度離心的方法分離大鼠原代HSCs,并進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及特性鑒定。以不同濃度的淫羊藿素溶液處理大鼠原代HSCs,應(yīng)用噻唑藍(lán)比色法(MTT 法)檢測(cè)不同濃度淫羊藿素溶液對(duì)大鼠原
4、代HSCs活化的抑制作用,通過免疫組化染色半定量分析方法分析不同濃度的淫羊藿素溶液對(duì)大鼠原代HSCs中α-SMA表達(dá)變化的影響。數(shù)據(jù)通過統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0進(jìn)行處理,結(jié)果以x_±s.d.表示,組間差異比較采用方差分析檢驗(yàn),方差非齊性采用非參數(shù)檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]
體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示:采用BDL 方法建立的膽汁淤積性大鼠肝纖維化動(dòng)物模型肉眼可見肝臟腫大呈棕黃色,表面細(xì)顆粒狀,部
5、分模型有大量黃綠色腹水;HE 染色光鏡下見正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,膽管增生伴膽管內(nèi)膽汁淤積明顯,造模末期可見纖維組織包繞肝小葉并形成明顯的纖維間隔。采用CCl4 腹腔注射誘導(dǎo)的化學(xué)損傷性大鼠肝纖維化模型肉眼可見肝臟腫大呈暗紅色,肝臟表面呈油膩感,部分模型腹腔內(nèi)有淡黃色積液;HE 染色光鏡下觀察肝細(xì)胞水腫、脂肪變性明顯,隨造模時(shí)間延長(zhǎng),肝組織內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),同時(shí)有大量膠原纖維組織增生并破壞肝小葉結(jié)構(gòu),造模末期有假小葉形成。經(jīng)過灌胃淫羊藿素治
6、療,與模型組相比,治療組大鼠的肝功能各項(xiàng)指標(biāo)較模型組均有所好轉(zhuǎn),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。免疫組化染色半定量分析的結(jié)果表明,模型組的炎癥區(qū)域附近有大量α-SMA 染色陽(yáng)性的活化型HSCs 存在,而淫羊藿素治療組的活化型HSCs的細(xì)胞數(shù)量則顯著下降(P<0.05)。
體外實(shí)驗(yàn):通過膠原酶原位灌注,Nycodenz 密度梯度離心的方法分離獲得大鼠原代HSCs,每只大鼠肝臟的細(xì)胞得率為3-4×107個(gè),經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)
7、判定細(xì)胞活率在90%以上,通過熒光顯微鏡觀察可見在328 nm 波長(zhǎng)的激發(fā)光下剛分離到的HSCs自發(fā)綠色熒光。取細(xì)胞爬片,進(jìn)行α-SMA免疫組化染色,判定細(xì)胞純度達(dá)95%以上。
分離培養(yǎng)大鼠原代HSCs,用1-64 μmol/L濃度倍比稀釋的淫羊藿素溶液作用原代HSCs細(xì)胞48 h后,可見原代HSCs的增殖受到明顯抑制,其抑制率隨淫羊藿素濃度的增加而遞增。繪制淫羊藿素作用12 h、24 h、48 h后大鼠原代HSCs的生長(zhǎng)
8、抑制曲線,可見隨淫羊藿素作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞抑制率相應(yīng)升高,并以16 μmol/L作用48 h后的抑制效果最為明顯。分別用16、32、48 μmol/L的淫羊藿素溶液處理大鼠原代HSCs,作用48 h后行α-SMA免疫組化染色半定量分析,α-SMA 染色陽(yáng)性的面積占總面積的百分比分別為34.31±12.68、36.72±10.68、30.25±11.58,與對(duì)照組70.24±20.46 相比差異顯著(P<0.05)。
[結(jié)
9、論]
1.淫羊藿素可以緩解大鼠膽汁淤積性肝纖維化和CCl4 誘導(dǎo)的化學(xué)損傷性肝纖維化的進(jìn)程,改善肝功能。
2.淫羊藿素降低了模型動(dòng)物纖維化肝組織中升高的α-SMA的表達(dá),抑制了纖維化肝組織中HSCs的活化。
3.原代分離的大鼠HSCs 具有活化型HSCs的生物學(xué)特性,是體外研究HSCs的一個(gè)重要模型。
4.淫羊藿素可以抑制大鼠原代HSCs 活化,這種抑制細(xì)胞活化增殖的效應(yīng)可能是淫羊
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