淫羊藿素抑制大鼠肝纖維化及原代肝星狀細(xì)胞活化的研究.pdf

1、[研究目的]
　　 建立穩(wěn)定可靠的大鼠肝纖維化動(dòng)物模型，觀察經(jīng)淫羊藿素灌胃給藥后大鼠肝功能指標(biāo)的改變及肝組織中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-Smooth muscle actin，α-SMA）表達(dá)的變化，并在此基礎(chǔ)上分離培養(yǎng)大鼠原代肝星狀細(xì)胞（Hepatic stellate cells，HSCs），探討淫羊藿素對(duì)原代HSCs 活化的抑制作用。
　　 [研究方法]
　　 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：通過膽管結(jié)扎（Bile duct li

2、gation，BDL）和四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的方法，分別建立膽汁淤積性和化學(xué)損傷性大鼠肝纖維化動(dòng)物模型。在肝纖維化形成后，給予大鼠灌胃淫羊藿素治療，給藥劑量為1mg/kg 體重，治療時(shí)間為3次/周，共持續(xù)4周。治療完成后，從大鼠股動(dòng)脈取血檢測(cè)肝功能指標(biāo)的變化，取肝組織行病理切片，通過HE 染色觀察大鼠肝臟損傷情況，通過免疫組化染色半定量分析肝組織內(nèi)α-SMA染色陽性的活化型HSCs的分布和表達(dá)程度，分析淫羊藿素對(duì)由膽汁淤積和化學(xué)損傷

3、引起的大鼠肝纖維化的緩解作用。數(shù)據(jù)通過統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0進(jìn)行處理，結(jié)果以x_±s.d.表示，組間均數(shù)差異比較采用方差分析（One-way ANOVA）檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 體外實(shí)驗(yàn)：通過膠原酶原位灌注消化，Nycodenz 密度梯度離心的方法分離大鼠原代HSCs，并進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及特性鑒定。以不同濃度的淫羊藿素溶液處理大鼠原代HSCs，應(yīng)用噻唑藍(lán)比色法（MTT 法）檢測(cè)不同濃度淫羊藿素溶液對(duì)大鼠原

4、代HSCs活化的抑制作用，通過免疫組化染色半定量分析方法分析不同濃度的淫羊藿素溶液對(duì)大鼠原代HSCs中α-SMA表達(dá)變化的影響。數(shù)據(jù)通過統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0進(jìn)行處理，結(jié)果以x_±s.d.表示，組間差異比較采用方差分析檢驗(yàn)，方差非齊性采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 [實(shí)驗(yàn)結(jié)果]
　　 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示：采用BDL 方法建立的膽汁淤積性大鼠肝纖維化動(dòng)物模型肉眼可見肝臟腫大呈棕黃色，表面細(xì)顆粒狀，部

5、分模型有大量黃綠色腹水；HE 染色光鏡下見正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，膽管增生伴膽管內(nèi)膽汁淤積明顯，造模末期可見纖維組織包繞肝小葉并形成明顯的纖維間隔。采用CCl4 腹腔注射誘導(dǎo)的化學(xué)損傷性大鼠肝纖維化模型肉眼可見肝臟腫大呈暗紅色，肝臟表面呈油膩感，部分模型腹腔內(nèi)有淡黃色積液；HE 染色光鏡下觀察肝細(xì)胞水腫、脂肪變性明顯，隨造模時(shí)間延長，肝組織內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤，同時(shí)有大量膠原纖維組織增生并破壞肝小葉結(jié)構(gòu)，造模末期有假小葉形成。經(jīng)過灌胃淫羊藿素治

6、療，與模型組相比，治療組大鼠的肝功能各項(xiàng)指標(biāo)較模型組均有所好轉(zhuǎn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。免疫組化染色半定量分析的結(jié)果表明，模型組的炎癥區(qū)域附近有大量α-SMA 染色陽性的活化型HSCs 存在，而淫羊藿素治療組的活化型HSCs的細(xì)胞數(shù)量則顯著下降（P＜0.05）。
　　 體外實(shí)驗(yàn)：通過膠原酶原位灌注，Nycodenz 密度梯度離心的方法分離獲得大鼠原代HSCs，每只大鼠肝臟的細(xì)胞得率為3-4×107個(gè)，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)

7、判定細(xì)胞活率在90％以上，通過熒光顯微鏡觀察可見在328 nm 波長的激發(fā)光下剛分離到的HSCs自發(fā)綠色熒光。取細(xì)胞爬片，進(jìn)行α-SMA免疫組化染色，判定細(xì)胞純度達(dá)95％以上。
　　 分離培養(yǎng)大鼠原代HSCs，用1-64 μmol/L濃度倍比稀釋的淫羊藿素溶液作用原代HSCs細(xì)胞48 h后，可見原代HSCs的增殖受到明顯抑制，其抑制率隨淫羊藿素濃度的增加而遞增。繪制淫羊藿素作用12 h、24 h、48 h后大鼠原代HSCs的生長

8、抑制曲線，可見隨淫羊藿素作用時(shí)間的延長，細(xì)胞抑制率相應(yīng)升高，并以16 μmol/L作用48 h后的抑制效果最為明顯。分別用16、32、48 μmol/L的淫羊藿素溶液處理大鼠原代HSCs，作用48 h后行α-SMA免疫組化染色半定量分析，α-SMA 染色陽性的面積占總面積的百分比分別為34.31±12.68、36.72±10.68、30.25±11.58，與對(duì)照組70.24±20.46 相比差異顯著（P＜0.05）。
　　 [結(jié)

9、論]
　　 1.淫羊藿素可以緩解大鼠膽汁淤積性肝纖維化和CCl4 誘導(dǎo)的化學(xué)損傷性肝纖維化的進(jìn)程，改善肝功能。
　　 2.淫羊藿素降低了模型動(dòng)物纖維化肝組織中升高的α-SMA的表達(dá)，抑制了纖維化肝組織中HSCs的活化。
　　 3.原代分離的大鼠HSCs 具有活化型HSCs的生物學(xué)特性，是體外研究HSCs的一個(gè)重要模型。
　　 4.淫羊藿素可以抑制大鼠原代HSCs 活化，這種抑制細(xì)胞活化增殖的效應(yīng)可能是淫羊