淫羊藿素抑制大鼠肝纖維化及原代肝星狀細胞活化的研究.pdf

1、[研究目的]
　　 建立穩(wěn)定可靠的大鼠肝纖維化動物模型，觀察經(jīng)淫羊藿素灌胃給藥后大鼠肝功能指標的改變及肝組織中α-平滑肌肌動蛋白（α-Smooth muscle actin，α-SMA）表達的變化，并在此基礎上分離培養(yǎng)大鼠原代肝星狀細胞（Hepatic stellate cells，HSCs），探討淫羊藿素對原代HSCs 活化的抑制作用。
　　 [研究方法]
　　 體內(nèi)實驗：通過膽管結扎（Bile duct li

2、gation，BDL）和四氯化碳（CCl4）誘導的方法，分別建立膽汁淤積性和化學損傷性大鼠肝纖維化動物模型。在肝纖維化形成后，給予大鼠灌胃淫羊藿素治療，給藥劑量為1mg/kg 體重，治療時間為3次/周，共持續(xù)4周。治療完成后，從大鼠股動脈取血檢測肝功能指標的變化，取肝組織行病理切片，通過HE 染色觀察大鼠肝臟損傷情況，通過免疫組化染色半定量分析肝組織內(nèi)α-SMA染色陽性的活化型HSCs的分布和表達程度，分析淫羊藿素對由膽汁淤積和化學損傷

3、引起的大鼠肝纖維化的緩解作用。數(shù)據(jù)通過統(tǒng)計軟件SPSS 16.0進行處理，結果以x_±s.d.表示，組間均數(shù)差異比較采用方差分析（One-way ANOVA）檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 體外實驗：通過膠原酶原位灌注消化，Nycodenz 密度梯度離心的方法分離大鼠原代HSCs，并進行細胞培養(yǎng)及特性鑒定。以不同濃度的淫羊藿素溶液處理大鼠原代HSCs，應用噻唑藍比色法（MTT 法）檢測不同濃度淫羊藿素溶液對大鼠原

4、代HSCs活化的抑制作用，通過免疫組化染色半定量分析方法分析不同濃度的淫羊藿素溶液對大鼠原代HSCs中α-SMA表達變化的影響。數(shù)據(jù)通過統(tǒng)計軟件SPSS 16.0進行處理，結果以x_±s.d.表示，組間差異比較采用方差分析檢驗，方差非齊性采用非參數(shù)檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 [實驗結果]
　　 體內(nèi)實驗顯示：采用BDL 方法建立的膽汁淤積性大鼠肝纖維化動物模型肉眼可見肝臟腫大呈棕黃色，表面細顆粒狀，部

5、分模型有大量黃綠色腹水；HE 染色光鏡下見正常肝小葉結構破壞，膽管增生伴膽管內(nèi)膽汁淤積明顯，造模末期可見纖維組織包繞肝小葉并形成明顯的纖維間隔。采用CCl4 腹腔注射誘導的化學損傷性大鼠肝纖維化模型肉眼可見肝臟腫大呈暗紅色，肝臟表面呈油膩感，部分模型腹腔內(nèi)有淡黃色積液；HE 染色光鏡下觀察肝細胞水腫、脂肪變性明顯，隨造模時間延長，肝組織內(nèi)有炎性細胞浸潤，同時有大量膠原纖維組織增生并破壞肝小葉結構，造模末期有假小葉形成。經(jīng)過灌胃淫羊藿素治

6、療，與模型組相比，治療組大鼠的肝功能各項指標較模型組均有所好轉(zhuǎn)，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。免疫組化染色半定量分析的結果表明，模型組的炎癥區(qū)域附近有大量α-SMA 染色陽性的活化型HSCs 存在，而淫羊藿素治療組的活化型HSCs的細胞數(shù)量則顯著下降（P＜0.05）。
　　 體外實驗：通過膠原酶原位灌注，Nycodenz 密度梯度離心的方法分離獲得大鼠原代HSCs，每只大鼠肝臟的細胞得率為3-4×107個，經(jīng)臺盼藍拒染實驗

7、判定細胞活率在90％以上，通過熒光顯微鏡觀察可見在328 nm 波長的激發(fā)光下剛分離到的HSCs自發(fā)綠色熒光。取細胞爬片，進行α-SMA免疫組化染色，判定細胞純度達95％以上。
　　 分離培養(yǎng)大鼠原代HSCs，用1-64 μmol/L濃度倍比稀釋的淫羊藿素溶液作用原代HSCs細胞48 h后，可見原代HSCs的增殖受到明顯抑制，其抑制率隨淫羊藿素濃度的增加而遞增。繪制淫羊藿素作用12 h、24 h、48 h后大鼠原代HSCs的生長

8、抑制曲線，可見隨淫羊藿素作用時間的延長，細胞抑制率相應升高，并以16 μmol/L作用48 h后的抑制效果最為明顯。分別用16、32、48 μmol/L的淫羊藿素溶液處理大鼠原代HSCs，作用48 h后行α-SMA免疫組化染色半定量分析，α-SMA 染色陽性的面積占總面積的百分比分別為34.31±12.68、36.72±10.68、30.25±11.58，與對照組70.24±20.46 相比差異顯著（P＜0.05）。
　　 [結

9、論]
　　 1.淫羊藿素可以緩解大鼠膽汁淤積性肝纖維化和CCl4 誘導的化學損傷性肝纖維化的進程，改善肝功能。
　　 2.淫羊藿素降低了模型動物纖維化肝組織中升高的α-SMA的表達，抑制了纖維化肝組織中HSCs的活化。
　　 3.原代分離的大鼠HSCs 具有活化型HSCs的生物學特性，是體外研究HSCs的一個重要模型。
　　 4.淫羊藿素可以抑制大鼠原代HSCs 活化，這種抑制細胞活化增殖的效應可能是淫羊