PTPRJ在肝星狀細(xì)胞中的表達(dá)及肝纖維化發(fā)生中的意義.pdf

1、肝纖維化即肝臟對(duì)各種病因所致慢性肝損傷的不完全修復(fù)過程，實(shí)質(zhì)為肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的過量沉積。肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，增殖并分泌膠原，是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。體內(nèi)各種促纖維化及抗纖維化因子通過調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞內(nèi)磷酸化活動(dòng)，精確調(diào)控著細(xì)胞上述活性。近年來，受體型蛋白酪氨酸激酶（RPIKs）如血小板源性生長因子受體（PDGFR）、血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）、表皮生長因子受體（EGFR）等在肝纖維化發(fā)生過程中的作用受到關(guān)注，相應(yīng)受體

2、蛋白酪氨酸激酶抑制劑作為抗纖維化治療藥物有望得到臨床應(yīng)用。但是，受體型蛋白酪氨酸磷酸酶（RPIPs），真核細(xì)胞內(nèi)控者胞內(nèi)磷酸化及去磷酸化反應(yīng)過程RPTKs的配對(duì)及抗衡分子，所起作用卻少有研究。 PTPRJ（Protein Tyrosine Phosphatase Receptor Type J）是受體型蛋白酪氨酸磷酸酶，胞內(nèi)為一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域，胞外為8個(gè)纖連蛋白樣重復(fù)結(jié)構(gòu)（FNⅢ域），在人類又稱為CD148，密度增強(qiáng)蛋白1（DEP

3、1），蛋白酪氨酸磷酸酶eta（HPTPeta），基因定位于11p11.2。蛋白分子由1337個(gè)氨基酸組成，大小約180-230KD；分布于淋巴造血系統(tǒng)、肝臟、胰腺、甲狀腺、腎臟、乳腺、胃腸道上皮、血管內(nèi)膜及神經(jīng)系統(tǒng)及多種腺癌組織。PTPRJ作用底物包括PDGFR、VEGFR、EGFR等多種生長因子受體酪氨酸激酶及下游激酶，使其去磷酸化而失活，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞間、細(xì)胞基質(zhì)間粘附，轉(zhuǎn)導(dǎo)生長抑素受體信號(hào)，調(diào)控免疫細(xì)胞分化活化、抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展。P

4、TPRJ基因敲除小鼠胚胎血管發(fā)育不良而夭折，PTPRJ基因座雜合子等位缺失（LOH）常見于人體各系統(tǒng)惡性腫瘤，而在結(jié)腸異常隱窩灶（ACF）中亦常見到。總之，作為一種潛在的抑癌基因，PTPRJ對(duì)于細(xì)胞去分化、增殖、遷徙等具有負(fù)性調(diào)控作用。 已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)：基底膜類似物Matrigel能夠逆轉(zhuǎn)肝星狀細(xì)胞活化，基因干擾、基因敲除、特異性激酶抑制劑等手段抑制PDGF（肝星狀細(xì)胞最強(qiáng)的增殖刺激因子）及下游酪氨酸激酶活性，是抑制肝星狀細(xì)胞增殖

5、的有效手段。PTPRJ正是介導(dǎo)Matrigel與細(xì)胞間作用的信號(hào)分子，且PTPRJ可選擇性去磷酸化PDG鄧-R，抑制PDGFR及下游激酶活化，可以推斷：PTPRJ可能介導(dǎo)Mtrigel逆轉(zhuǎn)肝星狀細(xì)胞活化，可以通過拮抗PDGF等生長因子受體及下游激酶活化抑制肝星狀細(xì)胞增殖，從而對(duì)于肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、增殖、遷徙具有重要負(fù)性調(diào)節(jié)作用。 但目前尚未證實(shí)PTPRJ在肝星狀細(xì)胞的表達(dá)，尚未研究在肝星狀細(xì)胞活化、轉(zhuǎn)分化及纖維化發(fā)生發(fā)展過程中是

6、否存在表達(dá)變化。總之，PTPRJ在肝纖維化發(fā)生中的意義尚未得到充分研究。 目的: 以肝纖維化發(fā)生過程中PTPRJ表達(dá)情況為研究對(duì)象，制備肝纖維化動(dòng)物模型，觀察大鼠肝纖維化發(fā)生過程中PTPRJ表達(dá)量的變化，同時(shí)建立Percoll梯度離心法分離培養(yǎng)原代大鼠肝星狀細(xì)胞，觀察PTPRJ在原代肝星狀細(xì)胞中的表達(dá)及在肝星狀細(xì)胞活化過程中的表達(dá)變化，初步探討PTPRJ在肝纖維化發(fā)生中的意義。 材料和方法: 清潔級(jí)雄性S

7、D大鼠36只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（12只）、造模組（24只），正常對(duì)照組皮下注射生理鹽水，造模組接受皮下注射400mg/L CC14/橄欖油溶液6ml/Kg 2次/周，3周、6周、9周結(jié)束時(shí)分別處死（末次皮下注射CC14后72h）正常對(duì)照組大鼠4只和造模組大鼠8只，取部分肝右葉做HE和Masson染色確定其病理變化，部分肝右葉進(jìn)行Western-blot檢測其中PTPRJ蛋白表達(dá)情況。另取清潔級(jí)雄性SD大鼠9只，膠原酶體外灌注、Perc

8、oll密度梯度離心法分離、培養(yǎng)原代肝星狀細(xì)胞，對(duì)照組為HSC-T6細(xì)胞，在培養(yǎng)第3、6、9天分別進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光檢測PTPRJ表達(dá)情況；同時(shí)在培養(yǎng)第3、6、9、12天使用RT-PCR法測定細(xì)胞中PTPRJ mRNA表達(dá)情況。 所有計(jì)量資料以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 13.0軟件，計(jì)量資料首先分析其正態(tài)及方差齊性。樣本量小，方差不齊，使用非參數(shù)多獨(dú)立樣本Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，

9、P≤0.05為分布差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: （1）肝組織病理學(xué)變化：HE染色顯示正常對(duì)照組肝組織無明顯異常。模型組3wk可見肝細(xì)胞氣球樣變性，匯管區(qū)部分炎性細(xì)胞浸潤；6wk肝細(xì)胞變性壞死明顯，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝界板不清，肝竇及匯管區(qū)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤，并可見纖維組織增生，9wk多數(shù)肝細(xì)胞壞死，大量炎性細(xì)胞浸潤，纖維間隔形成明顯、假小葉形成。Masson染色顯示正常對(duì)照組少量綠色的膠原纖維分布于匯管區(qū)和中央靜脈管壁

10、，模型組3wk、6wk、9wk可見粗大的綠色的膠原纖維沉積，且隨造模時(shí)間的延長而增多，與正常對(duì)照組差異有顯著性意義（P<0.05）。 （2）肝纖維化組織PTPRJ表達(dá)的變化：肝纖維化組織中隨著造模時(shí)間延長，PTPRJ表達(dá)減少，模型組3wk、6wk、9wk與對(duì)照組比較差異具有顯著性（P<0.05）。 （3）免疫熒光檢測原代肝星狀細(xì)胞培養(yǎng)第3天PTPRJ表達(dá)為陽性，而陰性對(duì)照（HSC-T6細(xì)胞）及空白對(duì)照組為陰性。培養(yǎng)第6天

11、肝星狀細(xì)胞可觀察到ERK、PTPRJ同時(shí)表達(dá)，而培養(yǎng)第9天活化后的肝星狀細(xì)胞可見α-SMA、PTPRJ同時(shí)表達(dá)。 （4）RT-PCR檢測原代肝星狀細(xì)胞PTPRJ mRNA表達(dá)為陽性，HSC-T6細(xì)胞中PTPRJ mRNA表達(dá)為陰性，在肝星狀細(xì)胞體外培養(yǎng)自活化過程中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，PIPRJ mRNA的表達(dá)逐步減少，差異有顯著性（P<0.05）。 主要結(jié)論: （1）原代肝星狀細(xì)胞中PTPRJ的表達(dá)為陽性，而H