大鼠Smad7真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及在肝星狀細(xì)胞中抗纖維化特性研究.pdf

1、目的：肝纖維化(HF)是多種慢性肝病病情發(fā)展的共同病理基礎(chǔ)和病理特征,是臨床肝病向肝硬化發(fā)展的中間環(huán)節(jié),是可逆性病變,以細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)增加為特征。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中最重要的促進(jìn)因子,是ECM沉積的關(guān)鍵介質(zhì),肝星狀細(xì)胞(HSC)活化則是其中心環(huán)節(jié)。Smad蛋白是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白,介導(dǎo)TGF-β由細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞核,Smad7負(fù)性調(diào)控TGF-β的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本研究構(gòu)建并鑒定大鼠Smad7基因pcDNA3.1(

2、+)真核表達(dá)質(zhì)粒,脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞,旨在觀察外源Smad7基因可否有效轉(zhuǎn)染肝星狀細(xì)胞并初步研究其抗纖維化的效果,為進(jìn)一步探討Smad7在TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的抗纖維化機(jī)制及用于肝纖維化治療做準(zhǔn)備。 方法：根據(jù)大鼠Smad7基因全序列,設(shè)計(jì)特異性引物,TRIzol法抽提冰凍大鼠肝組織總RNA,RT-PCR獲得Smad7 cDNA片段,應(yīng)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建Smad7/pcDNA3.1(+)重組質(zhì)粒,雙酶切證實(shí)

3、的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定。脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HSC-T6,分為正常對(duì)照、空質(zhì)粒組及轉(zhuǎn)染組,運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)HSC中Smad7及a-SMA定位和表達(dá),分別采用RT-PCR法和Western-blot法檢測(cè)HSC中Smad7 mRNA及蛋白水平的表達(dá):Western-blot檢測(cè)a-SMA表達(dá)；RT-PCR檢測(cè)TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：成功構(gòu)建大鼠Smad7真核表達(dá)質(zhì)粒；Smad7及a-SMA在胞漿中表達(dá)

4、,a-SMA表達(dá)陽(yáng)性提示HSC-T6被激活:Smad7轉(zhuǎn)染組與正常對(duì)照、空質(zhì)粒組比較:Smad7mRNA表達(dá)顯著增加1.053±0.009(P=0.009),蛋白水平明顯上調(diào)0.083±0.016(P=-0.020),a-SMA蛋白水平明顯下降0.518±0.085(P=0.032);Smad7轉(zhuǎn)染組TGF-β1、Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)降低0.961±0.013、0.592±0.096(P=0.000;P=0.004):Ⅲ型膠原mRNA表

5、達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義0.910±0.018(P=0.950)。正常對(duì)照、空質(zhì)粒組Smad7mRNA和蛋白水平、a-SMA蛋白水平、TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.944,0.644,0.612,0.595,0.967,0.950)。 結(jié)論： 1、大鼠Smad7/PcDNA3.1(+)真核細(xì)胞表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功； 2、Smad7及a-SMA在細(xì)胞漿中表達(dá),a-SMA表達(dá)陽(yáng)性提示HSC