轉(zhuǎn)染Smad7真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒對大鼠肝纖維化的療效觀察.pdf

1、背景與目的：肝纖維化（hepatic fibrosis）是慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)環(huán)節(jié)。目前研究認(rèn)為肝纖維化屬于可逆性病變，因此阻止和延緩肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展則是治療肝硬化的關(guān)鍵。 肝纖維化是由于細(xì)胞外基質(zhì)（extracelluar matrix，ECM）在肝內(nèi)過多沉積的結(jié)果；肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）激活是肝纖維化過程的中心事件，激活的HSC可合成大量的ECM沉積在肝組織中，Ⅰ、Ⅲ型膠原

2、為其主要組成成分；轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）是HSC活化并向肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast，MFB）轉(zhuǎn)化的最重要的促進(jìn)因子，其信號(hào)傳入依賴于其受體后信使分子SMAD蛋白來完成，即TGF-β/SMAD信號(hào)通路。Smad7是TGF-β/SMAD信號(hào)通路中的重要負(fù)性調(diào)節(jié)因子，通過抑制TGF-β的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮抗肝纖維化作用。目前有研究表明smad7可抑制Ⅰ型前膠原轉(zhuǎn)錄，但關(guān)于

3、Smad7對Ⅲ型前膠原表達(dá)的影響少有報(bào)道。 本研究利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建鼠Smad7真核表達(dá)重組質(zhì)粒，采用四氯化碳復(fù)合法制備大鼠肝纖維化模型，以脂質(zhì)體為載體將構(gòu)建的鼠Smad7重組質(zhì)粒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染肝纖維化模型大鼠。運(yùn)用western-blot定量檢測Smad7蛋白的表達(dá)，觀察外源Smad7基因能否有效轉(zhuǎn)染并表達(dá)；運(yùn)用VG染色和HE染色法觀察組織病理學(xué)改變，了解外源Smad7基因?qū)Υ笫蟾卫w維化模型病理組織學(xué)改變的影響；運(yùn)用免疫組化半定量

4、檢測Ⅲ型膠原纖維表達(dá)，觀察外源Smad7基因?qū)Υ笫蟾卫w維化模型Ⅲ型膠原纖維表達(dá)的影響。分析Smad7/pcDNA3.1（+）真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒對實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的影響。最終希望尋求一種防止和延緩各種慢性肝病肝纖維化和肝硬化發(fā)生、發(fā)展的有效方法并為肝纖維化的基因治療奠定理論基礎(chǔ)。 材料與方法：利用本課題組前期構(gòu)建的smad7真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒感受態(tài)細(xì)菌，使用上海生物工程公司UNIQ-500大劑量質(zhì)粒試劑盒制備大劑量的Sma

5、d7/pcDNA3.1（+）真核細(xì)胞表達(dá)重組質(zhì)粒。以脂質(zhì)體Lipofectmine2000為載體將質(zhì)粒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染肝纖維化模型大鼠，通過瓊脂糖凝膠電泳觀察摸索Smad7/pcDNA3.1（+）重組質(zhì)粒及pcDNA3.1（+）質(zhì)粒與脂質(zhì)體的配比關(guān)系。以經(jīng)認(rèn)證的同期出生、正常純種系雄性SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)對象。大鼠購回后適應(yīng)性飼養(yǎng)2周開始實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為4組：正常對照組（A組）、肝纖維化模型對照組（B組）、smad7質(zhì)粒治療組（C組）、空質(zhì)粒

6、組（D組）、每組20只。采用四氯化碳復(fù)合法制備大鼠肝纖維化模型。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行兩周后，各組隨機(jī)取材一只大鼠，病理學(xué)診斷確定受攻擊組大鼠進(jìn)入肝纖維化后，進(jìn)行干預(yù)治療。smad7質(zhì)粒治療組（C組）給予smad7/pcDNA3.1（+）重組質(zhì)粒，每次100μg，每9天1次至第8周，共腹腔注射5次，空質(zhì)粒組給予pcDNA3.1（+）空質(zhì)粒治療，方法及劑量同C組。8周后取材大鼠做以下相關(guān)檢測，比較各組實(shí)驗(yàn)大鼠的體重及肝重，Western-blot法檢測

7、各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝組織中smad7蛋白的表達(dá)，免疫組化檢測Ⅲ型膠原纖維的表達(dá)情況，并做半定量分析，應(yīng)用HE，VG染色法觀察肝組織病理形態(tài)學(xué)變化，進(jìn)行病理組織學(xué)診斷，使用SPSS11.5軟件分析描述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)特征，計(jì)量資料做方差分析，等級(jí)資料作Ridit分析。 結(jié)果： 1.Ⅲ型膠原纖維的表達(dá)治療組與模型對照組和空質(zhì)粒組比較，表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。各組與正常組比較，表達(dá)量增加，差異有顯著性（P<0.01）。

8、 2.Smad7蛋白的表達(dá)治療組相比較于模型對照組和空質(zhì)粒組，表達(dá)上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；各組表達(dá)量均顯著低于正常組，差異有顯著性（P<0.01）。 3.肝纖維化模型組和空質(zhì)粒組比較，Ⅲ型膠原纖維及smad7蛋白的表達(dá)量無顯著性差異（P>0.05）。 結(jié)論： 1.成功利用四氯化碳復(fù)合法制備大鼠肝纖維化模型。 2.以脂質(zhì)體Lipofectmine2000為載體將smad7/pcDN