愈肝顆?？垢卫w維化及其對(duì)Smad4、Smad7影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：通過(guò)研究愈肝顆粒對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中Smad4、Smad7蛋白分布與量的影響，結(jié)合肝功能、肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)及病理的檢測(cè)，探索愈肝顆?？箤?shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化的療效及作用機(jī)制。 方法：Wistar大鼠90只隨機(jī)分為9組，分別為正常對(duì)照四、六、八周組；模型對(duì)照四、六、八周組；愈肝顆粒四、六、八周組。用0.5％二甲基亞硝胺(Dimethylnitrosamine，DMN)按每次0.2ml/100g的劑量進(jìn)行腹腔注射(共10次)復(fù)

2、制成肝纖維化模型，正常對(duì)照組用等體積生理鹽水腹腔注射。實(shí)驗(yàn)第四周末，處死全部四周組動(dòng)物。從實(shí)驗(yàn)第五周起，愈肝顆粒組給予愈肝顆粒浸膏0.55ml/100g灌胃(相當(dāng)于成人臨床用藥劑量的6.5倍)，1次/天。正常對(duì)照組及模型對(duì)照組用清潔自來(lái)水0.55ml/100g灌胃，1次/天。分別于第六、八周末處死模型對(duì)照組和愈肝顆粒組的六、八周組動(dòng)物，收集血清及肝組織作標(biāo)本，作肝功能ALT、AST、ALB及肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)透明質(zhì)酸(Hyaluroni

3、cacid，HA)、層粘連蛋白(Laminin，LN)的檢測(cè)，病理切片觀測(cè)肝組織病理學(xué)變化并進(jìn)行肝臟炎癥活動(dòng)度和纖維化程度計(jì)分，作Smad4和Smad7的免疫組織化學(xué)染色觀察其表達(dá)的量及分布的變化，并用圖像分析軟件對(duì)它們表達(dá)的陽(yáng)性區(qū)域面積(Positivearea，PA)及光密度(Opticaldensity，OD)進(jìn)行半定量分析。 結(jié)果：(1)造模情況：①正常對(duì)照四周組與正常對(duì)照八周組比較：ALT、AST、ALB、HA、LN、

4、肝組織炎癥活動(dòng)度和纖維化程度計(jì)分、Smad4和Smad7的PA和OD值比較，P＞0.05。病理切片顯示兩組肝組織的肝小葉結(jié)構(gòu)都正常，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及肝細(xì)胞壞死，無(wú)纖維組織增生。免疫組化顯示：Smad4在兩組的肝細(xì)胞內(nèi)都無(wú)表達(dá)，在Disse間隙、匯管區(qū)及非實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)少量表達(dá)，Smad7只在兩組的肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)明顯表達(dá)。故實(shí)驗(yàn)時(shí)的腹腔注射、灌胃、抓取等處理因素對(duì)造模無(wú)影響。②模型對(duì)照四周組與正常對(duì)照四周組比較：模型對(duì)照四周組ALT、AS

5、T、HA、LN、肝組織炎癥活動(dòng)度和纖維化程度計(jì)分明顯升高，ALB明顯降低，以上均P＜0.01。肝臟炎癥壞死及纖維化明顯。免疫組化Smad4陽(yáng)性區(qū)域增寬，在門(mén)靜脈和中央靜脈周?chē)?、纖維間隔及炎性細(xì)胞中廣泛分布，PA和OD值明顯增高；而Smad7陽(yáng)性區(qū)域明顯減少，著色淺淡，只在少數(shù)肝細(xì)胞及擴(kuò)大的纖維間隔內(nèi)的梭狀細(xì)胞內(nèi)分布，PA和OD值也明顯降低。以上P值＜0.01，差異有顯著性。③模型四周組分別與模型六、八周組比較顯示：AST、ALT、ALB

6、、肝組織炎癥活動(dòng)度、纖維化計(jì)分，均P＞0.05。HA、LN隨造模時(shí)間延長(zhǎng)增高，在八周組最高，P值均＜0.01。肝組織病理改變顯示：六周組炎癥壞死最明顯，八周組炎癥活動(dòng)度減輕，而纖維化程度在三組間差異不大。免疫組化顯示：六周組Smad4陽(yáng)性染色區(qū)域最廣，伴染色團(tuán)塊狀增強(qiáng)，在肝細(xì)胞中也有少量表達(dá)，PA最高，P＜0.01，Smad4、Smad7其余各組的PA和OD的P值均＞0.05。 (2)愈肝顆粒治療情況：①愈肝顆粒六周組與四周組的

7、比較：AST、ATL、HA、LN和肝組織炎癥活動(dòng)度和纖維化程度計(jì)分顯著降低，P＜0.01，但ALB恢復(fù)不顯著，P＞0.05。病理切片顯示：肝臟炎癥及壞死減輕，纖維間隔變細(xì)，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂減輕。免疫組化中Smad4表達(dá)減少，著色變淺，主要位于門(mén)脈系統(tǒng)纖維間隔和肝小葉之間的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，其PA及OD值均降低，而Smad7表達(dá)明顯增多，著色變深，主要分布在肝細(xì)胞胞質(zhì)中，其PA及OD值也增加，以上P值均＜0.01，差異有顯著性。②愈肝顆粒八周組與

8、六周組比較：ALT、AST、HA、LN和肝組織炎癥活動(dòng)度和纖維化程度計(jì)分繼續(xù)降低，以上均P＜0.05，ALB也有所增加，但P＞0.05。病理切片示：炎癥、壞死病變基本消失，纖維化進(jìn)一步減少，肝組織結(jié)構(gòu)已基本正常。免疫組化中Smad4的表達(dá)繼續(xù)減少，著色淺淡，PA及OD值更低；Smad7陽(yáng)性染色區(qū)域繼續(xù)增加，有顆粒狀著色，肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)豐富，部分肝細(xì)胞核膜也有表達(dá)，PA及OD值更高，以上P位均＜0.01，差異有顯著性。③正常對(duì)照八周組與愈

9、肝顆粒八周組的比較：ALT、AST、ALB基本恢復(fù)正常，P值大于0.05，差異無(wú)顯著性。但HA、LN和炎癥活動(dòng)度和纖維化程度仍較正常組高，P＜0.05。病理改變顯示：愈肝顆粒8周組炎癥、壞死病變基本消失，只在匯管區(qū)和中央靜脈周?chē)匀挥猩倭磕z原纖維增生，但肝小葉結(jié)構(gòu)已基本正常。免疫組化中Smad4的PA仍較正常組多，P值＜0.01，但OD值已恢復(fù)正常，P＞0.05；Smad7表達(dá)面積及著色濃度仍較正常組少，PA及OD值仍低，P值均＜0.0

10、1，差異有顯著性。 結(jié)論：①DMN腹腔注射能成功誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，形成的肝纖維化模型較為穩(wěn)定，且病理改變類(lèi)似人類(lèi)的乙型肝炎，是研究肝纖維化發(fā)病與治療的較理想的模型之一。②Smad4/Smad7表達(dá)失衡及分布異常是造成大鼠肝纖維化的重要機(jī)制之一。③愈肝顆粒治療肝纖維化效果顯著，能明顯恢復(fù)肝功能，降低肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)，在病理上減輕肝臟炎癥壞死及肝纖維化，使Smad4表達(dá)減少，Smad7表達(dá)增高，并使二者分布趨于正常。④愈肝顆粒