軟肝顆?？垢卫w維化的實驗研究.pdf

1、肝纖維化是肝細(xì)胞壞死或損傷后常見的慢性進(jìn)行性肝病。肝纖維化中25％～40％最終發(fā)展為肝硬化乃至肝癌。當(dāng)前我國存在大量慢性肝炎患者，都存在不同程度的肝纖維化，若能找到一種服用方便、價廉、高效的抗肝纖維化藥物必將為廣大患者帶來福音。 軟肝顆粒是由黃芪、丹參、大黃、五味子、鱉甲、首烏、桃仁等組成的中成藥復(fù)方。近年的研究發(fā)現(xiàn)其中丹參的多種有效成分，如丹酚酸，丹參酮；黃芪的多種化學(xué)成分，如黃芪甙；大黃與首烏的有效成分，如大黃素，大黃酸等都

2、具有較好的抗肝纖維化作用。方中鱉甲入肝，軟肝散結(jié)，祛邪養(yǎng)陰為君藥；黃芪補人體之正氣，丹參、桃仁活血化瘀，同時輔以祛瘀能力較強的大黃；佐藥首烏養(yǎng)血益肝，五味子益氣養(yǎng)陰。全方共奏軟堅散結(jié)，活血化瘀之功效。 本研究采用CCL4加酒精的復(fù)合方法制成肝纖維化模型，選擇軟肝顆粒大劑量組(18g/kg大鼠)，軟肝顆粒中劑量組(9g/kg大鼠)，軟肝顆粒小劑量組(4.5g/kg大鼠)，復(fù)方鱉甲軟肝片組(0.9g/kg)對肝纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)(肝細(xì)

3、胞的保護(hù)，肝纖維化程度，細(xì)胞外基質(zhì)合成的影響)進(jìn)行研究，觀察了中藥復(fù)方軟肝顆粒在多環(huán)節(jié)阻抑肝纖維化病理過程的效應(yīng)特征。 實驗采用SD雄性大鼠120只，除了空白對照組，造模各組皮下注射40％CCL4花生油3ml/kg，每周2次，共8周；用10％酒精當(dāng)作唯一飲用水。造模同時給藥，造模8周，給藥12周。 取材，檢測血漿肝臟功能(生化指標(biāo))，放射免疫法檢測血清透明質(zhì)酸(HA)、層粘蛋白(LN)、4型膠原(Ⅳ-C)、3型前膠原(P

4、C-Ⅲ)，消化法檢測肝組織羥脯氨酸含量，肝組織石蠟切片HE染色、三色染色，TGF-β1免疫組化顯色，Ⅳ-C免疫組化顯色、α-SMA免疫組化顯色、免疫組化顯色。 實驗結(jié)果顯示： 1軟肝顆粒對肝纖維化大鼠肝細(xì)胞的保護(hù)作用 模型組大鼠從第2周開始到實驗結(jié)束體重增長明顯慢于正常組(P＜0.01或P＜0.05)，治療各組體重均高于模型組。 模型組與空白組比較，血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)有顯著的升高(P＜0.01

5、)；治療各組與模型組作比較，各組ALT均有明顯的降低(P＜0.01)。模型組與空白組比較，血清膽紅素(Bil)有顯著的升高(P＜0.05)；治療各組與模型組比較，軟肝顆粒18g/kg組、9g/kg組Bil有明顯的降低(P＜0.05)?？偟鞍?TP)含量的變化，各組無差異。模型組與空白組比較，血清白蛋白(ALB)有較顯著的降低(P＜0.05)；治療各組與模型組比較，軟肝顆粒4.5g/kg組ALB有明顯的升高(P＜0.01)，軟肝顆粒18g

6、/kg組、9g/kg組也有較顯著的升高(P＜0.05)。模型組與空白組比較，血清堿性磷酸酯酶(ASAT)有較顯著的升高(P＜0.05)；治療各組與模型組比較，軟肝顆粒9g/kg組、4.5g/kg組ASAT有明顯的降低(P＜0.01)，軟肝顆粒18g/kg組也有較顯著的降低(P＜0.05)。模型組與空白組比較，堿性磷酸酶(ALP)有較顯著的升高(P＜0.05)；治療各組與模型組作比較，軟肝顆粒9g/kg組、4.5g/kg組ALP有明顯的降

7、低(P＜0.01)，軟肝顆粒18g/kg組也有較顯著的升高(P＜0.05)。 由實驗結(jié)果得出，軟肝顆?？梢员Ｗo(hù)肝細(xì)胞，避免其受損時細(xì)胞膜的破壞導(dǎo)致其對肝星狀細(xì)胞(HSC)的接觸性抑制作用的喪失，從而抑制HSC的激活。2組織學(xué)病理改變 光學(xué)顯微鏡下觀察HE/三色染色切片標(biāo)本，充分顯示了各組大鼠肝臟的組織學(xué)病變特征： 空白組：正常組大鼠肝組織無異常表現(xiàn)。肝細(xì)胞索與肝血竇之比約為5：2。三色染色顯示肝門管區(qū)出現(xiàn)少量藍(lán)色

8、膠原纖維。 模型組：HE染色可見肝小葉正常結(jié)構(gòu)消失，增生的膠原纖維條索相互連接，完全分隔正常的肝小葉形成肝硬化；此時，形成了許多類圓形的肝細(xì)胞團為假小葉；其肝細(xì)胞索排列紊亂而不呈放射狀；肝索與肝竇的比例約為7：1；三色染色顯示纖維增生明顯，尤其在匯管區(qū)，肝小葉中央靜脈周圍呈現(xiàn)明顯的纖維化，致使中央靜脈管壁增厚，增生的纖維組織由小葉的中央，插入肝實質(zhì)內(nèi)，大致放射狀向小葉外周伸展，包繞單個或成簇的肝細(xì)胞。 用藥各組：病變特征

9、與模型組相似，但炎性細(xì)胞浸潤減少，肝細(xì)胞壞死及脂肪變性較輕；纖維增生減輕且不均一致；肝索與肝竇的比例在5：1到7：1之間；膽管增生不明顯。三色染色顯示纖維增生受到明顯抑制，肝小葉中央靜脈周圍呈現(xiàn)不明顯的纖維化，中央靜脈管壁也可見不同程度的增厚，插入肝實質(zhì)內(nèi)的增生纖維組織明顯減少。 3軟肝顆粒對肝纖維化程度的作用 羥脯氨酸在膠原蛋白中占13.4％，在彈性蛋白中占極少量，其它蛋白中均不存在。因此羥脯氨酸的量，計算成膠原的含量

10、，可以反應(yīng)纖維化的程度。測定血清Ⅲ型前膠原，其含量持續(xù)升高，提示肝纖維化進(jìn)展并可發(fā)展為肝硬化。模型組與空白組比較，肝組織中羥脯氨酸(Hyp)的含量有顯著升高(P＜0.01)；治療各組與模型組比較，軟肝顆粒9g/kg組、4.5g/kg組Hyp有明顯的降低(P＜0.01)，軟肝顆粒18g/kg組也有較顯著的降低(P＜0.05)。模型組與空白組比較，血清Ⅲ型前膠原(PCⅢ)的含量有較顯著的升高(P＜0.01)；治療各組與模型組作比較，各組PC

11、Ⅲ均有明顯的降低(P＜0.01) 由實驗結(jié)果得出，軟肝顆粒可以減輕肝纖維化大鼠的纖維化程度，從而有預(yù)防和治療肝纖維化的作用。 4軟肝顆粒對細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成的作用 ECM包括多種不溶性蛋白，它們構(gòu)成了間質(zhì)細(xì)胞的基質(zhì)及上皮細(xì)胞和血管的基底膜。在正常肝臟中，構(gòu)成ECM的分子種類據(jù)報道至少包括14種膠原、糖蛋白和蛋白多糖。肝纖維化時ECM在肝臟中過多積聚和沉積，ECM的最后組成有賴于外基質(zhì)的動態(tài)重建。 模

12、型組與空白組比較，肝組織中TGF-β1含量有顯著的升高(P＜0.01)；治療各組與模型組比較，TGF-β1均有明顯的降低(P＜0.01)。模型組與空白組比較，肝組織α-SMA含量有較顯著的升高(P＜0.01)；治療各組與模型組比較，α-SMA含量均有明顯的降低(P＜0.01)。模型組與空白組比較，血清低透明質(zhì)酸(HA)有較顯著的升高(P＜0.01)；治療各組與模型組比較，軟肝顆粒4.5g/kg組HA有明顯的降低(P＜0.05)。模型組與

13、空白組比較，組織Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)的含量有較顯著的升高(P＜0.01)；治療各組與模型組比較，Ⅳ-C的含量均有明顯的降低(P＜0.01)。模型組與空白組比較，血清Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)的含量有較顯著的升高(P＜0.01)；治療各組與模型組比較，Ⅳ-C的含量均有明顯的降低(P＜0.01)。模型組與空白組比較，血清層粘連蛋白(LN)的含量有較顯著的升高(P＜0.01)；治療各組與模型組作比較，軟肝顆粒18g/kg組、4.5g/kg組LN的含量有