化濁解毒調(diào)肝方對肝纖維化大鼠TGFβⅡ型受體及smad4蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、目的：本實驗通過無菌未滅活的豬血清腹腔注射的方法制備肝纖維化大鼠模型，探討化濁解毒調(diào)肝方抗大鼠肝纖維化的作用及其可能的機(jī)制，為肝纖維化的治療提供理論及實驗依據(jù)。主要內(nèi)容包括:觀察化濁解毒調(diào)肝方對肝纖維化大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響；化濁解毒調(diào)肝方對肝纖維化大鼠肝組織TGFβII型受體（TβRII）Mrna表達(dá)的影響；化濁解毒調(diào)肝方對肝纖維化大鼠肝組織smad4蛋白表達(dá)的影響。
　　 方法：清潔級Wistar大鼠50只，雄性，體重2

2、00-220g。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)抽取10只作為正常組。造模成功后將剩余40只大鼠隨機(jī)分為：模型對照組、秋水仙堿組（簡稱西藥治療組）、化濁解毒調(diào)肝方高劑量組（HZG）、化濁解毒調(diào)肝方低劑量組(HZD)，每組10只。各組均普通顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食，分籠飼養(yǎng)于20±2℃，濕度65％±5％清潔級動物實驗室內(nèi)。除正常對照組外，其余40只均采用未滅活的豬血清腹腔注射，每次0.5ml/只，固定時間為周一、周五上午9點，每周進(jìn)行兩次，連續(xù)8

3、周。秋水仙堿治療組和中藥治療組于造模的第8 周末給藥，化濁解毒調(diào)肝方低劑量組給予含1.5g/ml 生藥水煎劑灌胃；化濁解毒調(diào)肝方高劑量組給予含3.0g/ml 生藥水煎劑灌胃；秋水仙堿組給予0.154g/kg·d灌胃，均至12周末。每天上午灌胃一次，每次3ml，連續(xù)4 周。正常對照組與模型組給予等量生理鹽水灌胃。
　　 于第12 周末處死大鼠，留取大鼠肝組織，采用蘇木精-伊紅染色和Masson染色（膠原纖維特殊染色法）觀察肝組織病

4、理形態(tài)學(xué)的變化。采用RT-PCR技術(shù)測定肝組織TGFβII型受體（以下簡稱TβRII）Mrna 表達(dá)情況，采用免疫印跡法(Western-immunoblotting）測定大鼠肝組織中smad4蛋白的表達(dá)，所得數(shù)據(jù)經(jīng)過整理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理。兩個樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多個樣本均數(shù)比較行完全隨機(jī)設(shè)計單因素方差分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.一般情況：正常對照組大鼠食欲佳，被毛光

5、滑，精神狀態(tài)好，體重增加。模型組大鼠精神萎靡，活動減少，食欲減退，消瘦，皮毛無光澤，體重較前有所下降，進(jìn)食較正常組少、尿黃，有的大鼠鼻有出血。西藥治療組及中藥治療各組大鼠精神、食欲及活動介于正常組與模型組之間。
　　 2.化濁解毒調(diào)肝方對肝纖維化大鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)的影響肉眼觀察，正常組大鼠肝臟質(zhì)地軟，顏色呈深紅色，表面光滑，邊緣銳圓。模型組大鼠肝臟明顯腫大，質(zhì)地較硬，顏色片偏暗紅，表面有結(jié)節(jié)形成而粗糙不平，有的可見顆粒樣凸起，邊

6、緣較純。秋水仙堿組和中藥治療各組大鼠肝臟肝臟腫大不明顯，表面比較光滑，偶見沙粒樣增生，顏色略見暗紅，質(zhì)地較脆。
　　 光鏡下觀察，正常組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射狀的排列，肝細(xì)胞核大而圓，無變性壞死，未見明顯的纖維結(jié)締組織增生。模型組可見肝小葉結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，肝細(xì)胞廣泛的脂肪變性、壞死并伴炎性細(xì)胞浸潤，纖維組織大量增生，個別動物可見假小葉形成。中藥治療各組和西藥對照組肝組織病理的損傷程度與模型組相比均可見有不同程度

7、的修復(fù)，尤其是化濁解毒調(diào)肝方高劑量組，肝細(xì)胞脂肪變性及炎性細(xì)胞浸潤較模型組減少，膠原纖維增生較輕，主要散在于肝血竇和disse 間隙、匯管區(qū)，無假小葉形成。
　　 3.化濁解毒調(diào)肝方對肝纖維化大鼠肝組織TβRIImRNA表達(dá)的影響與正常對照組相比，模型對照組大鼠肝組織TβRIImRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)；
　　 化濁解毒調(diào)肝方高劑量組、低劑量組及秋水仙堿組與模型組相比TβRIImRNA的表達(dá)均有明顯下降(P<

8、0.01)；化濁解毒調(diào)肝方高劑量組與秋水仙堿組相比TβRIImRNA的表達(dá)有顯著性降低(P<0.01)；化濁解毒調(diào)肝方高劑量組與化濁解毒調(diào)肝方小劑量相比TβRIImRNA的表達(dá)有顯著性降低(P<0.01)；化濁解毒調(diào)肝方小劑量組與秋水仙堿組相比TβRIImRNA的表達(dá)無明顯差異（P>0.05）。
　　 4.化濁解毒調(diào)肝方對肝纖維化大鼠肝組織smad4蛋白表達(dá)的影響與正常對照組相比，模型對照組大鼠肝組織smad4 蛋白的表達(dá)量明顯

9、增強(qiáng)；化濁解毒調(diào)肝方高劑量組、低劑量組及秋水仙堿組與模型組相比smad4 蛋白的表達(dá)量均有明顯下降(P<0.01)；化濁解毒調(diào)肝方高劑量組與秋水仙堿組相比smad4 蛋白的表達(dá)量有顯著性降低(P<0.01)；化濁解毒調(diào)肝方高劑量組與化濁解毒調(diào)肝方小劑量相比smad4 蛋白的表達(dá)量有顯著性降低(P<0.01)；化濁解毒調(diào)肝方小劑量組與秋水仙堿組相比smad4 蛋白的表達(dá)量無明顯差異（P>0.05）。
　　 結(jié)論：
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