蘄艾提取液對肝纖維化大鼠TGFβ-Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響.pdf

1、研究背景與目的：
　　 肝纖維化是肝臟對不同病因所致的慢性損害產(chǎn)生的創(chuàng)傷愈合反應(yīng)，表現(xiàn)為肝臟細胞外基質(zhì)各種成分的過度沉積及分布異常，是纖維增生和纖維降解不平衡的結(jié)果，是多種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的中間病理階段，目前的研究認為肝纖維化病變經(jīng)過適當(dāng)?shù)姆e極治療有希望延緩甚至逆轉(zhuǎn)，而發(fā)展到肝硬化階段則很難逆轉(zhuǎn)。
　　 中醫(yī)藥治療肝纖維化具有多靶點、多環(huán)節(jié)、多途徑復(fù)合作用的特點，針對肝纖維化發(fā)病的復(fù)雜機制，體現(xiàn)了中醫(yī)藥的傳統(tǒng)優(yōu)勢。蘄

2、艾是湖北省的道地藥材，臨床研究發(fā)現(xiàn)蘄艾有明顯的抗肝纖維化的作用，本課題通過建立免疫性肝纖維化動物模型，初步了解蘄艾提取液抑制大鼠肝纖維化的作用，并通過其對大鼠肝組織中TGFβ-Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵的信號傳導(dǎo)分子TGFβ1、Smad3、Smad4、Smad7表達水平的變化，以及對抗凋亡基因Bcl-2和細胞周期蛋白的影響，探討蘄艾提取液抗肝纖維化的分子機理。
　　 方法：
　　 1.采用豬血清誘導(dǎo)肝纖維化模型，將72只

3、Wistar大鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照組、肝纖維化模型組、蘄艾提取液低劑量、中劑量和高劑量組及丹參治療組，每組12只。除正常對照組外，其余各組腹腔注射無菌豬血清0.3ml，每周2次，共10周。蘄艾提取液高、中和低劑量治療組分別給予6ml/只、3ml/只和1.5ml/只的蘄艾提取液灌胃，每日1次；丹參治療組給予丹參注射液6ml/只灌胃，每日1次；模型組給予生理鹽水6ml/只灌胃，每日1次；正常對照組大鼠按100g體重給予生理鹽水

4、0.3ml腹腔注射，每周2次，共10周，并給予生理鹽水6ml/只灌胃，每日1次。于10周末最后一次注射豬血清后48h，斷頭處死各組動物，眼球取血留取足夠的血，分離血清，并取一部分肝臟組織，4％福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋切片。一部分新鮮肝組織梯度置于-70℃保存，用于實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)法及蛋白印跡實驗(Westernblot)。
　　 2.血清學(xué)檢測：各組實驗大鼠血清分別檢測肝纖維化血清學(xué)指標透明質(zhì)酸

5、(HA)、層粘蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型前膠原(Ⅳ-C)的含量，以及脂質(zhì)過氧化指標超氧化物歧化酶(S0D)、丙二醛(MDA)。ELISA法檢測血清中TGFβ1含量。
　　 3.肝組織學(xué)檢測：采用HE染色和Masson三重膠原染色法觀察大鼠肝組織病理學(xué)變化。
　　 4.免疫組織化學(xué)檢測：采用免疫組化SABC法，結(jié)合顯微鏡，觀察大鼠肝組織TGFβ1、Smad3、Smad4、Smad7以及Bcl-2、Cyclin

6、 D1的表達變化。
　　 5.采用實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)法及蛋白印跡實驗(Western blot)分別檢測TGFβ1、Smad3、Smad4、Smad7 mRNA和蛋白及Bcl-2、cyclinDl mRNA和蛋白的表達變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.蘄艾提取液抑制大鼠肝纖維化作用的實驗研究
　　 與正常對照組比較，模型組中肝纖維化血清學(xué)指標HA、PCⅢ、LN、Ⅳ-C含量均明顯

7、升高(P＜0.01)，血清TGF-β1水平亦明顯升高(P＜0.05)，血清MDA含量上升、SOD活性顯著降低(P＜0.01)；與模型組比較，蘄艾提取液治療各組HA、PCⅢ、LN、Ⅳ-C含量均顯著降低(P＜0.05)，血清TGF-β1含量亦明顯下降(P＜0.05)，血清脂質(zhì)過氧化指標MDA含量顯著降低(P＜0.05)，SOD活性顯著升高(P＜0.05)，且蘄艾提取液治療組與正常對照組無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 光鏡下觀察

8、：模型組大鼠可見肝組織結(jié)構(gòu)部分破壞，肝細胞發(fā)生廣泛的變性水腫，水樣變性甚至氣球樣變性，還可見程度、范圍不等的肝細胞壞死；肝板排列紊亂，部分肝小葉失去正常結(jié)構(gòu)；匯管區(qū)纖維隔內(nèi)有大量嗜酸性細胞、單核淋巴細胞及成纖維細胞浸潤，大量膠原沉積，有較明顯纖維組織增生，膠原纖維沿匯管區(qū)及中央靜脈周圍向肝小葉內(nèi)延伸，可見相互連接的纖維分割肝小葉，甚至有部分區(qū)域有早期肝硬化表現(xiàn)。蘄艾提取液及丹參治療各組大鼠肝臟在色澤、質(zhì)地、大小、表面光滑度方面較模型組有

9、明顯改善，細胞變性和壞死程度顯著減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞不明顯，炎性細胞浸潤和纖維組織增生減少，中央靜脈和匯管區(qū)有少量纖維組織延伸，不同劑量蘄艾提取液治療組間無顯著性差異。2.蘄艾提取液對大鼠肝組織中TGFβ-Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白表達的影響
　　 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，TGFβ1、Smad3、Smad4在正常對照組肝細胞內(nèi)無陽性細胞表達，模型組肝內(nèi)表達明顯增強，主要見于間質(zhì)細胞、炎性細胞、損傷的肝細胞，陽性物質(zhì)主要集中在細胞膜上

10、，胞質(zhì)內(nèi)有少量表達；蘄艾提取液各劑量組及丹參組陽性細胞數(shù)目明顯減少，陽性染色程度明顯減輕。
　　 RT-PCR及Western blot檢測結(jié)果顯示，TGFβ1、Smad3、Smad4 mRNA及其蛋白，在正常對照組中表達明顯低下，而Smad7 mRNA及其蛋白表達則明顯升高；蘄艾提取液高、中、低劑量組TGFβ1、Smad3、Smad4 mRNA及其蛋白與模型組比較表達逐漸減少，Smad7 mRNA及其蛋白表達與模型組比較則逐漸

11、升高，其中中、高劑量組TGFβ1、Smad3、Smad7 mRNA及其蛋白與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)，而與丹參組比較無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 3.蘄艾提取液對抗凋亡基因Bcl-2及細胞周期蛋白Cyclin D1表達的影響
　　 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，Bcl-2及Cyclin D1蛋白在正常對照組肝細胞內(nèi)無陽性細胞表達，模型組肝內(nèi)表達明顯增強，主要見匯管區(qū)、肝細胞、間質(zhì)細胞膜上及細胞

12、漿內(nèi)，陽性物質(zhì)主要集中在細胞膜上；蘄艾提取液各劑量組及丹參組陽性細胞數(shù)目明顯減少，陽性染色程度明顯減輕。
　　 RT-PCR及Western blot檢測結(jié)果顯示，正常對照組Bcl-2、Cyclin D1mRNA及蛋白表達較模型組低下，蘄艾提取液各劑量組Bcl-2、Cyclin D1mRNA及蛋白表達較模型組逐漸減少，其中高劑量組與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)，與正常對照組和丹參組比較無顯著性差異(P＞0.05)。

13、r>　　 結(jié)論：
　　 1.蘄艾提取液可以明顯改善豬血清誘導(dǎo)的大鼠免疫性肝纖維化的肝組織病理學(xué)損害，減輕纖維組織增生，明顯減少膠原纖維間隔、肝細胞壞死、變性以及炎性細胞的浸潤，并能有效降低肝纖維化血清學(xué)指標，其抗纖維化的機理可能與抗脂質(zhì)過氧化有關(guān)。
　　 2.蘄艾提取液能夠顯著抑制大鼠肝組織中TGFβ1、Smad3、Smad4 mRNA及其蛋白表達水平，上調(diào)Smad7 mRNA及其蛋白表達水平，表明其可能通過有效調(diào)控T