鱉甲煎丸與羅格列酮對(duì)由TGF-β1刺激的大鼠肝星狀細(xì)胞活化和TGF-β-Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響.pdf

1、目的：肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是各種致病因素引起的肝損傷的修復(fù)反應(yīng)，同時(shí)又是慢性肝病進(jìn)展成肝硬化的共同病理基礎(chǔ)及必經(jīng)階段。我國(guó)是肝病高發(fā)國(guó)家，以慢性乙型肝炎、丙型肝炎最常見(jiàn)，嚴(yán)重影響我國(guó)人民平均壽命和生活質(zhì)量，故阻止或逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)程是治療慢性肝病、改善預(yù)后的重要手段。肝纖維化主要特征是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)合成增多、降解減少，從而在肝內(nèi)過(guò)度沉積。肝星狀細(xì)胞(hepatic

2、 stellate cells，HSC)是肝臟合成ECM的主要來(lái)源細(xì)胞，其激活、增殖后表達(dá)各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，合成大量ECM，是形成肝纖維化的中心環(huán)節(jié)。TGF-β1是目前已知的功能最明確和作用最強(qiáng)的促肝纖維化細(xì)胞因子，在促進(jìn)HSCs合成分泌ECM中發(fā)揮重要作用。TGF-β1與HSCs表面具有高親和力的TGF-β受體(TGF-β receptor，TβR)結(jié)合形成TGF-β1-TβR復(fù)合體，而后進(jìn)一步磷酸化下游信號(hào)因子-Smad蛋白，將信號(hào)

3、轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，啟動(dòng)HSCs活化增殖。隨著肝纖維化發(fā)生機(jī)制的不斷闡明，中西醫(yī)都在進(jìn)行防治肝纖維化的有益探索。一些西藥的研究取得了一定進(jìn)展，如過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體γ(peroxisome proliferators-activatedreceptorgamma，PPARγ)，是一種配體激活的核受體轉(zhuǎn)錄因子，靜止?fàn)顟B(tài)HSC表達(dá)PPARγ，而活動(dòng)狀態(tài)的HSC表達(dá)PPARγ明顯減少，PPARγ表達(dá)減少與HSC激活密切相關(guān)。目前認(rèn)為羅格列酮是

4、PPARγ的配體，作為PPARγ的激動(dòng)劑，可增加肝內(nèi)膠原酶活性，減少肝內(nèi)膠原積聚和抑制HSC的增殖。在中醫(yī)藥方面，以活血化瘀為主的中醫(yī)藥(traditional Chinesemedicine，TCM)治療肝纖維化亦取得一定效果，中藥對(duì)肝纖維化有良好的預(yù)防和治療作用，且具有多環(huán)節(jié)、多層次、多靶點(diǎn)的綜合藥理學(xué)特點(diǎn)及低毒副作用的優(yōu)點(diǎn)。鱉甲煎丸以往系列研究證實(shí)具有抑制膠原合成及HSC活化增殖、改善肝功能的作用，但作用機(jī)制尚未明確。本項(xiàng)研究采用

5、中藥血清藥理學(xué)的方法，通過(guò)觀察不同濃度鱉甲煎丸藥物血清對(duì)TGF-β1刺激的大鼠HSC活化增殖、TGF-β1/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及ECM合成的影響，探討鱉甲煎丸抗肝纖維化作用及可能機(jī)制，并與羅格列酮相比較。
　　方法：
　　1采用血清藥理學(xué)方法制備大鼠藥物血清，將25只大鼠按體重隨機(jī)分為五組，鱉甲煎丸與羅格列酮均用無(wú)菌蒸餾水制備藥物混懸液，鱉甲煎丸分別按成人劑量的3.5、7、14倍灌胃給藥，作為中藥低、中、高劑量組；羅格列酮

6、按成人劑量的7倍灌胃給藥，作為西藥組；對(duì)照組灌服等體積蒸餾水。給藥7次后下腔靜脈取血，制備藥物血清，配置10％大鼠含藥血清的FBS-DMEM培養(yǎng)液作為藥物治療組：10％正常大鼠血清的FBS-DMEM培養(yǎng)液作為對(duì)照組，含5ug/L[1]TGF-β1的10％正常大鼠血清的FBS-DMEM培養(yǎng)液作為模型組。模型組和四個(gè)治療組分別加入模型組培養(yǎng)液24h后，吸去上清液，再加入對(duì)照組和各治療組藥物血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
　　2藥物血清體外培養(yǎng)H

7、SC及指標(biāo)檢測(cè)：應(yīng)用HSC細(xì)胞株體外培養(yǎng)技術(shù)，在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)液中貼壁后，換用無(wú)血清DMEM同步化培養(yǎng)24h，再換用各組干預(yù)培養(yǎng)基按上述方法干預(yù)細(xì)胞24h，進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)：①吸光度(optical density，OD)：MTT法②ColⅣ，LN：放射免疫法③TβRⅠ、TβRⅡ、Smad3、Smad7：反轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)(RT-PCR)。
　　結(jié)果：
　　1 MTT結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，模型組及除鱉

8、甲煎丸高劑量組之外的各藥物干預(yù)組OD值明顯增高(P＜0.05)；與模型組相比，各藥物干預(yù)組OD值均明顯減低(P＜0.05)；與羅格列酮組相比，鱉甲煎丸高劑量組OD值明顯減低(P＜0.05)，鱉甲煎丸中劑量組OD值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，鱉甲煎丸低劑量組OD值明顯增高(P＜0.05)；鱉甲煎丸低、中、高劑量組OD值依次減低(P＜0.05)；鱉甲煎丸高劑量組和對(duì)照組OD值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　2放免結(jié)果顯示：與對(duì)照

9、組相比，模型組及各藥物干預(yù)組ColⅣ，LN含量明顯增高(P＜0.05)；與模型組相比，各藥物干預(yù)組CoⅣ，LN含量均明顯減低(P＜0.05)；與羅格列酮組相比，鱉甲煎丸高劑量組ColⅣ，LN含量明顯減低(P＜0.05)，鱉甲煎丸中劑量組ColⅣ，LN含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，鱉甲煎丸低劑量組ColⅣ，LN含量明顯增高(P＜0.05)；憋甲煎丸低、中、高劑量組ColⅣ，LN含量依次減低(P＜0.05)。
　　3 RT-PCR

10、結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，模型組及各藥物干預(yù)組TβRⅠ、TβRⅡ、Smad3表達(dá)明顯增高，各藥物干預(yù)組Smad7 mRNA表達(dá)明顯增高(P＜0.05)；與模型組相比，各藥物干預(yù)組TβRⅠ、TβRⅡ、Smad3 mRNA表達(dá)均明顯減低，Smad7 mRNA表達(dá)明顯增高(P＜0.05)；對(duì)照組與模型組Smad7 mRNA表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；與羅格列酮組相比，鱉甲煎丸高劑量組TβRⅠ、TβRⅡ、Smad3 mRNA表達(dá)明顯減低，S

11、mad7 mRNA表達(dá)明顯增高(P＜0.05)，鱉甲煎丸中劑量組TβRⅠ、TβRⅡ、Smad3、Smad7
　　mRNA表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，鱉甲煎丸低劑量組TβRⅠ、TβRⅡ、Smad3 mRNA表達(dá)明顯增高，Smad7 mRNA表達(dá)明顯降低(P＜0.05)；鱉甲煎丸低、中、高劑量組TβRⅠ、TβRⅡ、Smad3 mRNA表達(dá)依次減低，Smad7 mRNA表達(dá)依次增高(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1

12、 TGF-β1可在TβR、Smads不同位點(diǎn)激活TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)HSC增殖活化和ECM合成分泌；抑制性蛋白Smad7對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的負(fù)反饋?zhàn)饔貌荒艹志?，這可能是肝纖維化持續(xù)發(fā)展的原因之一。
　　2不同劑量鱉甲煎丸和羅格列酮藥物血清均可抑制TGF-β1上述作用，其作用可能與在不同位點(diǎn)抑制TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。但其對(duì)下游因子的作用是否為對(duì)上游因子作用的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。