甘草酸對大鼠肝星狀細胞TGF-β1-smad信號通路的影響.pdf

1、肝纖維化是多種慢性肝病的共同病理基礎。肝纖維化發(fā)展的各個時期，肝星狀細胞的活化和細胞外基質(zhì)合成與降解的失衡是重要病理機制。其中轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF—B1)起了關鍵作用。TGF-β信號通過跨膜絲氨酸／蘇氨酸受體激酶傳遞入核，胞漿內(nèi)進化保守的smad蛋白家族起了重要的轉(zhuǎn)導作用。它們主要分為3類：受體調(diào)控型smads(R—smads)可直接與活化的I型受體結(jié)合而磷酸化：共同介導型smads(Co—smads)是必需的中轉(zhuǎn)分子，當R-sma

2、ds磷酸化并與之形成寡聚體后可轉(zhuǎn)位入核調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄；抑制型smads(I—smads)是TGF—B信號通路的負反饋調(diào)節(jié)。其中Smad2、3、4、7參與了信號轉(zhuǎn)導。 甘草酸是目前廣泛應用于臨床的有效的慢性肝病治療藥物。它可能通過誘導干擾素Q，抑制白介素6和腫瘤壞死因子表達，誘生前列腺素E，抑制磷脂酶A2的活性而起作用的。既往研究提示甘草酸可能通過干預TGF—β／smad信號通路來發(fā)揮抗纖維化作用的，但具體機制尚待進一步明確。

3、 目的：研究甘草酸對TGF—B1刺激的大鼠肝星狀細胞中TGF—β／smad信號通路的影響。以期揭示甘草酸抗纖維化的分子機制。 方法：用SD大鼠分離肝星狀細胞并體外培養(yǎng)。實驗分成對照組和不同濃度甘草酸給藥組(1umol／卜1000μmol／1)。用MTT法研究對細胞增殖的抑制，臺盼藍拒染法和上清液LDH測定來研究對細胞活力的影響。ELISA法測定上清中HSC分泌的TGF-Bl。Westernblot法檢測α．SMA蛋白質(zhì)表達水

4、平。采用GEArray基因芯片檢測對照組，TGF—B1組，TGF-β1+甘草酸100μmol／L組的基因表達，篩選與TGF-B／smad通路相關的有變化意義的靶基因。然后分成6組，分別為對照組、TGF-B1組、TGF-Bl+不同濃度甘草酸組(1umol／l一1000umol／1)。采用半定量RT-PCR法檢測smad2、smad3、smad?、Q2I型前膠原、QlIII型前膠原、纖溶酶原激活物抑制因子一1、TGFβ2型受體mRNA水平，

5、采用Westernblot法檢測smad2、磷酸化-smad2、smad3、胞核-smad3、smad?、I型膠原、III型膠原、纖溶酶原激活物抑制因子一1和TGFβ2型受體蛋白質(zhì)表達水平。 結(jié)果：MTT實驗顯示100umol／L一1000umol／L甘草酸能明顯抑制肝星狀細胞增殖但不同濃度甘草酸并不影響肝星狀細胞的活力。不同濃度甘草酸能逐漸抑制α-SMA蛋白質(zhì)表達水平。1000μmol／L甘草酸能抑制上清液中肝星狀細胞分泌的T

6、GF-β1。基因芯片結(jié)果表明：經(jīng)TGFB1作用后表達上調(diào)，再經(jīng)甘草酸作用后表達下調(diào)的基因有16項；經(jīng)TGFβ1作用后表達下調(diào)，再經(jīng)甘草酸作用后表達上調(diào)的基因有5項；經(jīng)TGFβ1作用后表達上調(diào)，再經(jīng)甘草酸作用后表達上調(diào)更加明顯的基因有2項。其中有7項基因與TGF—B／smad通路相關。RTR-PCR和Westernblot結(jié)果驗證了與基因芯片的一致性。表明TGF—B1能增加smad2、smad3、smad7、Q2I型前膠原、Q1III型前

7、膠原、纖溶酶原激活物抑制因子一1、TGFB2型受體mRNA表達水平，同樣增加smad2，磷酸化-smad2、smad3、胞核一smad3、smad7、I型膠原、III型膠原、纖溶酶原激活物抑制因子一1、TGFB2型受體蛋白質(zhì)表達。lumol／卜1000umol／1甘草酸能逐漸降低smad2、smad3、smad7、I型膠原、III型膠原、纖溶酶原激活物抑制因子一l的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平，但增加TGFB2型受體的mRNA水平和蛋白質(zhì)表

8、達。 結(jié)論：高濃度甘草酸能抑制肝星狀細胞增殖和TGF-β分泌；不同濃度的甘草酸能減少smad2、smad3、smad7、I型膠原、III型膠原、纖溶酶原激活物抑制因子一1的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平，但上調(diào)TGFβ2型受體mRNA和蛋白質(zhì)表達水平轉(zhuǎn)化生長因子(transforminggrowthfactorbetaTGFβ)是一類能夠調(diào)節(jié)細胞生長和分化的多肽，具備多種生物學作用。在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中具有活化肝星狀細胞(hepa

9、tocelluarstellatecellHSC)、促進膠原基因表達、促進細胞外基質(zhì)合成與沉積等作用，是最重要的促肝纖維化細胞因子之一。大量研究證實TGFB／Smad信號轉(zhuǎn)導通路是TGFB發(fā)揮生物學作用的主要通路，其分子組成與分子調(diào)節(jié)復雜，與其它信號通路存在廣泛的交互影響，對不同的組織細胞及肝纖維化的不同病程的作用均有明顯的差異。對TGFβ／Smad信號轉(zhuǎn)導通路的深入研究不僅使肝纖維化的發(fā)病機制得到進一步的闡明，也給肝纖維化的防治研究提