18α甘草酸對(duì)肝組織膠原及TGFβ1-Smad信號(hào)通路的影響.pdf

1、背景及目的:
　　氧化應(yīng)激、肝星狀細(xì)胞(HSC)以及細(xì)胞因子都是肝臟纖維化形成的重要機(jī)制。甘草酸有廣泛的藥理功能,有肝細(xì)胞保護(hù)作用。我們采用四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型,研究18α甘草酸(18α GL)對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化的作用,并分別從氧化應(yīng)激、HSC活化凋亡以及膠原和細(xì)胞因子這幾個(gè)角度探討其可能的機(jī)制。
　　方法:
　　1.建立動(dòng)物模型:采用40％CCl4皮下注射方法建立肝纖維化模型。動(dòng)物分為正常對(duì)照組

2、、肝纖維化模型組和18α GL干預(yù)組(低、中、高劑量)。八周后,取血清做肝功能及透明質(zhì)酸(HA)檢測(cè),測(cè)定肝臟組織羥脯氨酸(HYP)含量,做HE&Masson染色觀察病理情況。
　　2.檢測(cè)肝臟組織丙二醛(MDA)、4羥基壬烯酸(HNE)含量及超氧化物酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)活力。
　　3.免疫組化觀察Ⅰ、Ⅲ型膠原、α SMA和NF-KB、TGFβ1、p-Smad2、p-Smad3、Smad7和SP-

3、1的分布及量的變化,WB檢測(cè)Smad2和Smad3表達(dá),采用圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析。
　　4.TUNEL檢測(cè)組織中細(xì)胞凋亡,以及TUNEL和αSMA雙染檢測(cè)HSC凋亡。
　　5.Signal-Net分析與I型膠原直接相關(guān)的基因,real time PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.18α GL能夠明顯改善纖維化大鼠組織病理學(xué)變化,降低Ⅰ、Ⅲ型膠原的沉積、HYP含量和血清HA的表達(dá),抑制CCl4誘導(dǎo)

4、的肝纖維化進(jìn)程。結(jié)果顯示CCl4大鼠肝纖維化模型組有MDA和HNE水平的升高,而18α GL可以上調(diào)肝組織內(nèi)SOD和GSH-PX酶的活力,降低脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA和HNE產(chǎn)量。
　　2.18α GL能夠抑制肝纖維化大鼠肝臟組織中α SMA的蛋白和轉(zhuǎn)錄水平并促進(jìn)活化HSC的凋亡。18α GL能夠顯著下調(diào)肝臟組織中凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl-2的轉(zhuǎn)錄水平,并且通過(guò)免疫組化發(fā)現(xiàn)NF-κB在纖維化模型組主要在核內(nèi)表達(dá),而18α GL組則主

5、要在胞漿內(nèi)表達(dá)。
　　3.18α GL能夠改善纖維化大鼠I型膠原相關(guān)COL1A1和COL1A2的mRNA水平,且能抑制活化的肝星狀細(xì)胞株中I型膠原的轉(zhuǎn)錄。Signal-Net網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)與COL1A1和COL1A2直接相關(guān)的基因中,與TGF-β/Smad、Rho/rock、MAPK、PDGF和MMP等信號(hào)通路相關(guān),動(dòng)物體內(nèi)18α GL可引起RAC、RHOA、HSPB、SMAD3、SP-1和MMP2、MMP9下調(diào),而細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)在活

6、化的肝星狀細(xì)胞株中18α GL對(duì)Smad3的抑制更顯著。
　　4.18α GL能顯著降低肝纖維化組織中TGF-β1、Smad2、Smad3的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平,免疫組化還發(fā)現(xiàn)18α GL能夠減少磷酸化Smad2、磷酸化Smad3和轉(zhuǎn)錄因子SP-1的表達(dá),而不伴隨Smad7的顯著改變。
　　結(jié)論:
　　18α GL能夠顯著改善纖維化大鼠肝臟組織病理學(xué)變化,通過(guò)提高肝臟組織中SOD和GSH-PX活力,增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化能力,抑制脂