MAPK通路調(diào)控下經(jīng)TGF-β1-Smad信號途徑的肝纖維化-肝癌發(fā)病機制研究.pdf

1、背景：
　　肝纖維化是指由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，導致肝內(nèi)彌漫性細胞外基質(zhì)（Extracellular matrix, ECM）過度沉積的病理過程，它不是一個獨立的疾病，許多慢性肝臟疾病均可引起肝纖維化，其發(fā)病率和病死率位均居全球前列。肝纖維化既是各種慢性肝病發(fā)展的共同結(jié)果，又是肝硬化的必經(jīng)階段，更是肝細胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）的前兆。引起肝纖維化的因素包括肝炎病毒、慢性酒精

2、中毒、非酒精性脂肪性肝炎、藥物、工業(yè)毒物、肝靜脈回流受阻、血吸蟲病、自身免疫性肝炎、膽汁淤積、遺傳代謝疾病和隱源性肝炎等。我國是病毒性肝炎高發(fā)國家，全球有慢性乙型肝炎病毒感染者約3.5億，丙型肝炎病毒感染者1.7億，而其中我國約有1.2億HBV和400萬HCV感染者。慢性乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒感染引起慢性肝臟炎癥，促進了肝纖維化，進一步發(fā)展成肝硬化，從而大大增加了發(fā)生肝細胞癌的風險，相關(guān)研究顯示超過85％的肝細胞癌與慢性HCV、HB

3、V感染有關(guān)。在目前尚無有效方法根治原發(fā)疾病的情況下，深入的研究肝纖維化形成和發(fā)展的分子機制，尋找相應的特異性治療靶點，以阻止或逆轉(zhuǎn)纖維化的進展，從而防止其進一步發(fā)展為肝硬化、甚至肝癌，便成為十分重要的治療目標。
　　肝纖維化發(fā)病機制的相關(guān)研究顯示肝星狀細胞（HSC)激活與轉(zhuǎn)化是肝臟纖維化形成的關(guān)鍵。而轉(zhuǎn)化生長因子-β1（Transforming growth factor beta-1, TGF-β1）在肝臟纖維化形成的過程中起著

4、非常重要的作用。TGF-β1是促進HSC活化，并促進HSC表達ECM的關(guān)鍵因子。TGF-β1能促進HSC合成彈性蛋白、粘著蛋白、膠原及蛋白聚糖等細胞外基質(zhì)，減少降解蛋白酶的合成，從而阻止新合成ECM的分解，打破了ECM合成與降解的平衡，使 ECM的沉積增多,加速肝臟纖維化的發(fā)展。TGF-β1的促纖維化作用主要通過下游 Smads家族傳遞信號，相關(guān)研究表明TGF-β/Smad信號途徑在肝纖維化的發(fā)病機制中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。此外，除了Smad

5、信號，TGF-β1還可以激活絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase, MAPK）信號轉(zhuǎn)導通路，主要包括 c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（Extracellular signal-regulated kinase, ERK）和p38激酶三個亞族。我們前期的研究結(jié)果表明在 HepG2細胞中TGF-β1有可能通過 JNK和p3

6、8信號途徑促進了Smad2/3、Smad3L的磷酸化。
　　在此基礎之上，本課題將繼續(xù)研究MAPK通路對TGF-β1/Smad信號轉(zhuǎn)導的其他重要環(huán)節(jié)調(diào)控的作用機制。
　　目的：
　　1.闡明HepG2細胞內(nèi)MAPK通路對TGF-β1/Smad信號轉(zhuǎn)導的調(diào)控作用；
　　2.闡明HSC細胞內(nèi)MAPK通路對TGF-β1/Smad信號轉(zhuǎn)導的調(diào)控作用。
　　方法：
　　1.細胞培養(yǎng)與處理
　　HSC細胞或

7、HepG2細胞在無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，加或不加三種MAPK抑制因子（ERK抑制因子PD98059、JNK抑制因子SP600125、p38抑制因子SB203580）共培養(yǎng)5 h；然后根據(jù)不同的實驗，加入不同濃度的TGF-?1，不同的刺激時間；對照組加入等量的溶媒。本課題中各實驗至少重復三次。
　　2.免疫沉淀與western blot法檢測HSC細胞或HepG2細胞內(nèi)Smad2/3磷酸化以及Smad2/3/4復合物的表達

8、　　培養(yǎng)結(jié)束后提取 HSC細胞或 HepG2細胞總蛋白，細胞提取物中加入抗-Smad2/3抗體進行免疫沉淀，隨后分別利用針對Smad2/3連接區(qū)和C-末端磷酸化位點的特異性抗體：抗-pSmad3C、抗-pSmad3L、抗-pSmad2C、抗-pSmad2L)，檢測細胞內(nèi) Smad2/3連接區(qū)和C-末端磷酸化水平；并利用抗-Smad4抗體檢測與Smad2/3結(jié)合的Smad4，即Smad2/3/4復合物，以細胞內(nèi)Smad2/3蛋白和細胞提取

9、物中的Smad4蛋白作為參照。
　　3.細胞免疫熒光染色法檢測HSC細胞或HepG2細胞內(nèi)磷酸化Smad2/3及MAPKs蛋白的細胞內(nèi)定位表達
　　HSC細胞或HepG2細胞接種于24孔板內(nèi)的無菌玻片上，培養(yǎng)結(jié)束后取出細胞玻片進行固定、封閉，分別與相應的抗體孵育過夜，然后再與熒光標記的二抗孵育，在熒光顯微鏡下觀察磷酸化Smad2/3以及MAPKs蛋白的細胞內(nèi)定位表達并拍照。
　　4.Western blot法檢測HSC

10、細胞或HepG2細胞內(nèi)Imp7/Imp8和MAPKs蛋白表達
　　培養(yǎng)結(jié)束后提取HepG2細胞或HSC細胞總蛋白，采用western blot法，以非磷酸化ERK1/2, JNK1/2, pp38為參照，檢測細胞內(nèi)pERK1/2, pJNK1/2, pp38表達；以GAPDH為內(nèi)參，檢測細胞內(nèi)Imp7/Imp8蛋白表達水平。
　　5.實時定量RT-PCR法HHSC細胞或HepG2細胞內(nèi)PAI-1mRNA水平
　　培養(yǎng)結(jié)

11、束后提取HepG2細胞或HSC細胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，分別利用各自引物進行內(nèi)參基因β-actin和靶基因PAI-1的SYBR Green I實時定量PCR反應，利用循環(huán)閾值（Threshold cycles, CT）計算PAI-1mRNA的相對表達量，以β-actin為內(nèi)參；根據(jù)融解曲線確定擴增反應特異性。
　　結(jié)果：
　　1.三種MAPK抑制因子對TGF-β1誘導的HSC細胞磷酸化Smad3L蛋白表達和轉(zhuǎn)位的影

12、響
　　在無TGF-β1刺激條件下，Smad3C、Smad3L磷酸化程度很低且核內(nèi)表達很弱。TGF-β1可誘導Smad3L磷酸化，并促進pSmad3L入核；三種MAPK抑制因子(10μM)均可抑制pSmad3L磷酸化。JNK抑制因子可抑制pSmad3L入核。
　　2.三種MAPK抑制因子對TGF-β1誘導的HSC細胞中Smad4細胞內(nèi)定位的影響
　　TGF-β1可誘導Smad4表達增加，并促進其入核；三種MAPK抑制因

13、子均可抑制Smad4入核，但對其表達無顯著影響。
　　3. Western blot法檢測三種MAPK抑制因子對TGF-β1誘導HSC細胞內(nèi)Imp7/ Imp8蛋白表達的影響
　　3.1、 Western blot法檢測三種MAPK抑制因子對TGF-β1誘導HSC細胞內(nèi)Imp7蛋白表達的影響
　　在無 TGF-β1刺激條件下，Imp7蛋白表達程度很低且核內(nèi)表達很弱。TGF-β1可誘導Imp7表達及入核；三種MAPK抑制

14、因子均可抑制Imp7表達及入核。
　　3.2、 Western blot法檢測三種MAPK抑制因子對TGF-β1誘導HSC細胞內(nèi)Imp8蛋白表達的影響
　　在無TGF-β1刺激條件下， Imp8蛋白表達程度很低且核內(nèi)表達很弱。TGF-β1可誘導Imp8表達及入核；三種抑制因子均可抑制 Imp8表達，p38抑制因子可減少Imp8入核。
　　4.三種MAPK抑制因子對TGF-β1誘導的HSC細胞內(nèi)PAI-1mRNA表達的影

15、響
　　TGF-β1可明顯誘導PAI-1mRNA表達， ERK、JNK及p38抑制因子均能抑制TGF-β1誘導的PAI-1mRNA表達。
　　5.三種MAPK抑制因子對TGF-β1誘導的HepG2細胞內(nèi)MAPK通路活化的抑制作用
　　5.1、 ERK抑制因子(PD98059)對TGF-β1誘導的HepG2細胞內(nèi)ERK通路活化的抑制作用
　　在無TGF-β1刺激時，HepG2細胞內(nèi)的ERK通路已有一定程度磷酸化；T

16、GF-β1則進一步增強pERK的表達。而ERK抑制因子(PD98059)可明顯抑制pERK的表達。
　　5.2、 JNK抑制因子(SP600125)對TGF-β1誘導的HepG2細胞內(nèi)JNK通路活化的抑制作用
　　在無TGF-β1刺激時，HepG2細胞內(nèi)的JNK通路已存在明顯磷酸化；TGF-β1則進一步增強pJNK的表達。而JNK抑制因子(SP600125)可明顯抑制pJNK的表達。5.3 p38抑制因子(SB203580)

17、對TGF-?1誘導的HepG2細胞內(nèi)p38通路活化的抑制作用
　　在無TGF-β1刺激時，HepG2細胞內(nèi)的JNK通路已存在明顯磷酸化；TGF-β1則進一步增強pp38的表達。而p38抑制因子(SB203580)可明顯抑制pp38的表達。
　　6.三種MAPK抑制因子對HepG2細胞內(nèi)TGF-β1誘導的磷酸化Smad3C、Smad3L轉(zhuǎn)位的影響
　　在無TGF-β1刺激條件下，Smad3C及Smad3L磷酸化程度很低且

18、核內(nèi)表達很弱。TGF-β1可誘導Smad3C、Smad3L磷酸化，并促進pSmad3C、pSmad3L入核。ERK抑制因子、JNK抑制因子顯著可抑制Smad3L磷酸化及其入核，p38抑制因子抑制Smad3L磷酸化，但對其核漿分布無明顯影響。TGF-β1及三種MAPK抑制因子對Smad3C磷酸化均未見顯著影響,但TGF-β1增加pSmad3C入核，三種MAPK抑制因子可抑制pSmad3C入核。
　　7.三種MAPK抑制因子對TGF-

19、β1誘導HepG2細胞內(nèi)Smad2/3/4復合物形成的影響
　　在無TGF-β1刺激的對照組HepG2細胞中，無Smad2/3/4復合物形成，TGF-β1可顯著誘導 Smad2/3/4復合物形成；p38抑制因子(SB203580)幾乎完全阻斷Smad2/3/4復合物的形成；JNK抑制因子(SP600125)呈濃度依賴性抑制 TGF-β1誘導的Smad2/3/4復合物形成；ERK抑制因子(PD98059)對復合物形成沒有明顯影響。各

20、組HepG2細胞內(nèi)Smad2/3蛋白的表達量沒有變化，同時細胞提取物中Smad4蛋白的表達量在各組間也沒有差異。
　　8. Western blot法檢測三種MAPK抑制因子對TGF-β1誘導HepG2細胞內(nèi)Imp7/Imp8蛋白表達的影響
　　8.1、 Western blot法檢測三種MAPK抑制因子對TGF-β1誘導HepG2細胞內(nèi)Imp7蛋白表達的影響
　　在無 TGF-β1刺激條件下，Imp7蛋白表達程度很低

21、且核內(nèi)表達很弱。TGF-β1可誘導Imp7表達及入核；三種MAPK抑制因子均可抑制Imp7入核，尤其是p38抑制因子。
　　8.2、 Western blot法檢測三種MAPK抑制因子對TGF-β1誘導HepG2細胞內(nèi)Imp8蛋白表達的影響
　　在無TGF-β1刺激條件下， Imp8蛋白表達程度很低且核內(nèi)表達很弱。TGF-β1可誘導Imp8表達及入核。ERK抑制因子、JNK抑制因子可抑制Imp8入核，p38抑制因子對Imp8

22、核漿分布無明顯影響。
　　9.三種MAPK抑制因子對TGF-β1誘導的HepG2細胞內(nèi)PAI-1mRNA表達的影響
　　TGF-β1可明顯誘導PAI-1mRNA表達，ERK、JNK及p38抑制因子均能抑制TGF-β1誘導的PAI-1mRNA表達。
　　結(jié)論：
　　5.1、 TGF-β1誘導HSC細胞及HepG2細胞中Smad3C及Smad3L磷酸化、進而促進Smad2/3/4復合物形成及其轉(zhuǎn)位入核和靶基因 PAI

23、-1mRNA表達可能是肝纖維化-肝癌發(fā)病的重要機制，而其中TGF-β1誘導的Smad3L的磷酸化可能是肝纖維化-肝癌發(fā)病的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　5.2、在HSC細胞中ERK、JNK、P38抑制因子均可明顯抑制TGF-β1誘導pSmad3L的表達，JNK抑制因子可抑制pSmad3L入核；提示，Smad3蛋白連接區(qū)的磷酸化依賴于ERK、JNK、p38通路的激活，而pSmad3L轉(zhuǎn)位入核則主要與JNK通路的激活有關(guān)。而在HepG2細胞中ER

24、K抑制因子、JNK抑制因子顯著可抑制Smad3L磷酸化及其轉(zhuǎn)位入核，p38抑制因子抑制Smad3L磷酸化，但對其核漿分布無明顯影響。三種MAPK抑制因子均可抑制pSmad3C轉(zhuǎn)位入核。提示，在HepG2細胞中Smad3L磷酸化依賴于ERK、JNK、p38通路的激活，而pSmad3L轉(zhuǎn)位入核則主要與ERK、JNK通路的激活有關(guān)。pSmad3C的轉(zhuǎn)位入核則與ERK、JNK、p38通路的激活有關(guān)。
　　5.3、在HSC細胞中三種MAPK

25、抑制因子均可抑制Smad2/3/4復合物入核，但對其表達無顯著影響。提示，在HSC細胞中Smad2/3/4復合物的形成主要受p38、ERK通路的調(diào)控，而 Smad2/3/4復合物的轉(zhuǎn)位入核主要受到 JNK通路的調(diào)控。而在HepG2細胞中p38抑制因子(SB203580)幾乎完全阻斷 Smad2/3/4復合物的形成；JNK抑制因子(SP600125)呈濃度依賴性抑制TGF-?1誘導的Smad2/3/4復合物形成；ERK抑制因子(PD980

26、59)對復合物形成沒有明顯影響。提示，在 HepG2細胞中Smad2/3/4復合物的形成主要受p38、JNK通路的調(diào)控，而Smad2/3/4復合物的轉(zhuǎn)位入核主要受到ERK、JNK通路的調(diào)控。
　　5.4、在HSC細胞中，三種MAPK抑制因子均可抑制Imp7表達及入核。三種抑制因子均可抑制Imp8表達，p38抑制因子可減少Imp8入核。提示，在HSC細胞中ERK、JNK通路對Smad2/3/4復合物的轉(zhuǎn)位入核的調(diào)控可能與Imp7/

27、Imp8的表達及 Imp7的入核有關(guān)；而 p38通路對Smad2/3/4復合物的轉(zhuǎn)位入核的調(diào)控可能與Imp7/Imp8表達及入核有關(guān)。而在HepG2細胞中，三種MAPK抑制因子均可抑制Imp7入核，尤其是p38抑制因子。ERK抑制因子、JNK抑制因子可抑制Imp8入核，p38抑制因子對Imp8核漿分布無明顯影響。提示，在HepG2細胞中，ERK、JNK通路對Smad2/3/4復合物的轉(zhuǎn)位入核的調(diào)控可能與Imp7/ Imp8的入核有關(guān)；p

28、38通路對Smad2/3/4復合物的轉(zhuǎn)位入核的調(diào)控可能與Imp7的入核有關(guān)。
　　5.5、 ERK、JNK、P38抑制因子均能明顯抑制 HSC細胞內(nèi) TGF-β1誘導的靶基因PAI-lmRNA的表達。提示，ERK、JNK、p38通路均參與HSC細胞內(nèi)TGF-β1信號通路靶基因PAI-1轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控。ERK、JNK、P38抑制因子均能明顯抑制HepG2內(nèi)TGF-β1誘導的靶基因PAI-lmRNA的表達。提示，ERK、JNK、p38

29、通路均參與HepG2內(nèi)TGF-β1信號通路靶基因PAI-1轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控。
　　總之，在HSC細胞內(nèi)p38、ERK通路可能主要通過調(diào)控Smad3蛋白連接區(qū)的磷酸化及Smad2/3/4復合物的形成而影響靶基因PAI-1的轉(zhuǎn)錄， JNK通路主要通過調(diào)控Smad2/3/4復合物的轉(zhuǎn)位入核影響靶基因PAI-l轉(zhuǎn)錄。而在HepG2細胞內(nèi)p38通路可能主要通過調(diào)控Smad3蛋白連接區(qū)的磷酸化及Smad2/3/4復合物的形成而影響靶基因PAI-