Arkadia-Smad7介導TGF-β信號通路的正向調(diào)控與腎纖維化的關系.pdf

1、TGF-β<,1>，在腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)病機制中起到重要的作用，具體過程可能與其誘導腎小管上皮細胞轉分化有關。TGF-β<,1>的生物學效應是通過其激活的信號轉導通路介導得以實現(xiàn)，而Smads蛋白對GF-β信號轉導通路激活狀態(tài)的維持至關重要。Smad7能夠與R-Smad(Smad2、Smad3)競爭性地與被激活的FGF-β受體結合從而阻止Smad2、Smad3與 TGF-β受體結合及其隨后的磷酸化過程，最終導致TGF-β/Smad信號

2、轉導通路的生物學效應被抑制(減弱)。研究表明，在多種組織、器官纖維化發(fā)生過程中，病變組織及細胞中Smad7蛋白表達明顯低于正常對照組；而上調(diào)Smad7蛋白的表達則能夠減輕或逆轉纖維化。可見，在纖維化的發(fā)生過程中，Smad7對Smads介導的TGF-β信號通路的調(diào)節(jié)起到關鍵作用。研究顯示，泛素-蛋白酶體通路通過對Smads的降解而達到調(diào)節(jié)TGF-β信號轉導通路的生物學效應。在上述過程中，E3泛素連接酶(如Arkadia和Smurfs)的參

3、與作用十分重要。同時研究表明，Smad7能夠將E3泛素連接酶招募至TGF-β受體，之后與他們發(fā)生相互作用最終E3泛素連接酶通過蛋白酶體將TGF-β受體及Smad7降解。有學者利用UUO大鼠模型對Smurfs和Smad7在腎纖維化過程中的作用機制進行了相關研究，結果發(fā)現(xiàn)，在TGF-β/Smad信號通路的生物學效應上調(diào)的同時，伴隨有Smad7 mRNA表達的上調(diào)及Smad7蛋白表達水平的顯著下降，而且表明Smad7的下調(diào)是由于泛素蛋白酶體通

4、路的降解作用所致。由此似乎可以推論Smurfs通過介導Smad7的降解能夠放大(增強)TGF-β信號轉導通路的生物學效應。然而，該研究僅僅就Smurfs和Smad7的關系進行了探討，而對TGF-βⅠ型受體(TβRI)在UUO大鼠腎臟組織中的表達情況以及TβRI與Smurfs之間的相互作用關系并未涉及。此外，其他的E3泛素連接酶在腎纖維化中對Smad7蛋白的作用仍然需要闡明。另有研究表明，Smurfs通過與Smad7的結合降解TGF-β受

5、體導致TGF-β信號通路的減弱，這與上述推論(Smurfs通過降解Smad7能夠放大TGF-β信號轉導通路在腎纖維化發(fā)病機制中的生物學效應)似乎存在矛盾。與Smurfs有所不同，另一E3泛素連接酶Arkadia對TGF-β受體并無降解作用，它可以直接降解Smad7從而達到放大TGF-β信號轉導通路生物學效應的作用。鑒于Arkadia介導Smad7的降解作用具有相對特異性，探討二者在腎小管間質(zhì)纖維化以及與此密切關聯(lián)的腎小管上皮細胞轉分化過

6、程中的相互作用及其機制對腎纖維化的防治具有一定的理論意義。 第一章 Arkadia-Smad7介導TGF-β信號通路的正向調(diào)控與腎小管間質(zhì)纖維化的關系 目的:利用UUO大鼠模型，初步探討腎小管間質(zhì)纖維化過程中Arkadia、Smurf2、Smad7及TβRI等信號分子在TGF-β/Smad信號轉導通路中相互作用關系及其表達變化。 方法:SD大鼠隨機分為模型組和假手術組(sham組)，模型組每組6只：UUO術后3天

7、組、UUO術后7天組、UUO術后14天組及UUO術后28天組；假手術組每組4只。采用單側(左)輸尿管結扎方法，建立梗阻性腎小管間質(zhì)纖維化大鼠模型，Sham組只游離輸尿管而不結扎。分別于術后3天、7天、14天、28天處死動物，取結扎側腎臟；同時處死假手術組大鼠，取出腎組織。觀察各組間腎臟病理學變化，采用免疫組化、Western-blot、RT-PCR及免疫共沉淀等方法檢測Arkadia、Smurfs與Smad7、TβRI等表達變化及其相互

8、作用關系。 結果:光鏡下假手術組大鼠腎組織無明顯變化，模型組大鼠隨著輸尿管結扎時間的延長，其腎組織逐漸出現(xiàn)腎小管進行性擴張、彌漫性炎癥細胞浸潤，間質(zhì)面積增寬、部分腎小管萎縮、腎小管上皮細胞空泡樣變性，最終出現(xiàn)腎小管結構遭到嚴重破壞，代之以浸潤的炎性細胞和彌漫增生的纖維組織。 與假手術組相比，RT-PCR顯示模型組大鼠腎組織中Col-1 mRNA及TGF-β1 mRNA的表達隨梗阻時間延長而逐漸增強；與假手術組相比，Wes

9、tem Blot及RT-PCR均顯示模型組大鼠腎組織中Arkadia及其mRNA表達逐漸增強；與假手術組相比，RT-PCR顯示模型組大鼠腎組織中Smad7 mRNA表達逐漸增強，而免疫組化及Westem Blot則顯示模型組大鼠腎組織中Smad7蛋白質(zhì)表達逐漸較弱；與假手術組相比，Westem Blot顯示模型組大鼠腎組織中Smurf2、TβRI蛋白質(zhì)表達逐漸增強。 免疫共沉淀顯示，用Smad7抗體沉淀后，用相應的抗體行West

10、ernBlot檢測顯示Arkadia-Smad7復合物、Smurf2-Smad7復合物及TβRI-Smad7復合物在模型組及假手術組大鼠腎組織中均有表達。用TβRI抗體沉淀后，用相應的抗體行Western Blot檢測顯示Arkadia-TβRI復合物在模型組及假手術組大鼠腎組織中均無表達；Smurf2-TβRI復合物、Smad7-TβRI復合物在模型組及假手術組大鼠腎組織中均有表達。 結論: Arkadia-Smad7介導TG

11、F-β信號通路的正向調(diào)控在一定程度上促進了腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展。 第二章 Arkadia-Smad7介導TGF-β信號通路的正向調(diào)控與腎小管上皮細胞轉分化的關系 目的:通過觀察Arkadia-siRNA及蛋白酶體抑制劑(Lactacystin)對Smad7的影響及由此所致的TGF-β<,1>誘導腎小管上皮細胞轉分化過程變化，借以探討Arkadia和Smad7在腎小管上皮細胞轉分化過程中相互作用及其基本機制。

12、 方法:常規(guī)培養(yǎng)正常人腎小管上皮細胞(HKC)，用TGF-β<,1>對HKC細胞進行刺激，在此過程中分別用Arkadia-siRNA、Smurf2-siRNA及Lactacystin對HKC細胞進行預處理。采用Western-blot、RT-PCR、免疫細胞化學及免疫共沉淀方法分別檢測Arkadia、Smurfs與Smad7、TβRI等信號分子及腎小管上皮細胞轉分化代表性物質(zhì)(α-SMA、E-cadherin)及Col-I在HKC細胞中

13、的表達變化及其相互作用關系。 結果:與對照HKC相比，RT-PCR和Western Blot均顯示，TGF-β<,1>干預能夠使Arkadia及其mRNA在HKC中表達上調(diào)；與對照HKC相比，RT-PCR顯示，TGF-β<,1>干預能夠使Smad7 mRNA在HKC中表達上調(diào)，而Western Blot則顯示，TGF-β<,1>干預能夠使Smad7蛋白在HKC中表達下調(diào)；與對照HKC相比，Western Blot均顯示，TGF-

14、β<,1>干預能夠使Smurf2及Tp砒蛋白質(zhì)在HKC中表達上調(diào)。 免疫共沉淀顯示，用Smad7抗體沉淀后，用相應抗體行WesternBlot檢測顯示，Arkadia-Smad7復合物、Smurf2-Smad7復合物及TβRI-Smad7復合物在TGF-β<,1>刺激HKC及未刺激HKC中均有表達。用TβRI抗體沉淀后，用相應抗體行Western Blot檢測顯示，Arkadia-TβRI復合物在刺激組及對照組HKC中均無表達；

15、Smurf2-TβRI復合物及Smad7-TβRI復合物在刺激組及對照組HKC中均有表達。 RT-PCR和Western Blot均顯示，Arkadia-siRNA能夠顯著抑制TGF-β<,1>對Arkadia的誘導表達作用。與TGF-β<,1>刺激HKC組相比，RT-PCR顯示，Arkadia-siRNA及Lactacystin對TGF-β<,1>誘導Smad7mRNA的減少無明顯影響；Western Blot及免疫細胞化學顯示，Ar

16、kadia-siRNA及Lactacystin均可部分上調(diào)TGF-β<,1>對Smad7蛋白表達的減少作用。與TGF-β<,1>刺激HKC組相比，Western Blot顯示，Smurf2-siRNA及Lactacystin的干預均能使TGF-β<,1>對HKC中Smurf2蛋白的誘導作用受到抑制；Lactacystin能夠上調(diào)TGF-β<,1>對Smad7蛋白的減少作用，而Smurf2-siRNA則無此作用。Western Blot顯

17、示，Lactacystin能夠下調(diào)TGF-β<,1>對HKC中TβRI蛋白的誘導作用，而Arkadia-siRNA則對HKC中TβRI蛋白表達無明顯影響。 RT-PCR和Western Blot均顯示，TGF-β<,1>干預能夠使HKC中Col-1及其mRNA、α-SMA及其mRNA的表達逐漸上調(diào)，使E-cadherin及其mRNA的表達減弱，Arkadia-siRNA及Lactacystin則能夠部分逆轉TGF-β<,1>的上