Arkadia-Smad7介導(dǎo)TGF-β信號通路的正向調(diào)控與腎纖維化的關(guān)系.pdf

1、TGF-β<,1>，在腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制中起到重要的作用，具體過程可能與其誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化有關(guān)。TGF-β<,1>的生物學(xué)效應(yīng)是通過其激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)得以實(shí)現(xiàn)，而Smads蛋白對GF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活狀態(tài)的維持至關(guān)重要。Smad7能夠與R-Smad(Smad2、Smad3)競爭性地與被激活的FGF-β受體結(jié)合從而阻止Smad2、Smad3與 TGF-β受體結(jié)合及其隨后的磷酸化過程，最終導(dǎo)致TGF-β/Smad信號

2、轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的生物學(xué)效應(yīng)被抑制(減弱)。研究表明，在多種組織、器官纖維化發(fā)生過程中，病變組織及細(xì)胞中Smad7蛋白表達(dá)明顯低于正常對照組；而上調(diào)Smad7蛋白的表達(dá)則能夠減輕或逆轉(zhuǎn)纖維化?？梢?，在纖維化的發(fā)生過程中，Smad7對Smads介導(dǎo)的TGF-β信號通路的調(diào)節(jié)起到關(guān)鍵作用。研究顯示，泛素-蛋白酶體通路通過對Smads的降解而達(dá)到調(diào)節(jié)TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的生物學(xué)效應(yīng)。在上述過程中，E3泛素連接酶(如Arkadia和Smurfs)的參

3、與作用十分重要。同時研究表明，Smad7能夠?qū)3泛素連接酶招募至TGF-β受體，之后與他們發(fā)生相互作用最終E3泛素連接酶通過蛋白酶體將TGF-β受體及Smad7降解。有學(xué)者利用UUO大鼠模型對Smurfs和Smad7在腎纖維化過程中的作用機(jī)制進(jìn)行了相關(guān)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在TGF-β/Smad信號通路的生物學(xué)效應(yīng)上調(diào)的同時，伴隨有Smad7 mRNA表達(dá)的上調(diào)及Smad7蛋白表達(dá)水平的顯著下降，而且表明Smad7的下調(diào)是由于泛素蛋白酶體通

4、路的降解作用所致。由此似乎可以推論Smurfs通過介導(dǎo)Smad7的降解能夠放大(增強(qiáng))TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的生物學(xué)效應(yīng)。然而，該研究僅僅就Smurfs和Smad7的關(guān)系進(jìn)行了探討，而對TGF-βⅠ型受體(TβRI)在UUO大鼠腎臟組織中的表達(dá)情況以及TβRI與Smurfs之間的相互作用關(guān)系并未涉及。此外，其他的E3泛素連接酶在腎纖維化中對Smad7蛋白的作用仍然需要闡明。另有研究表明，Smurfs通過與Smad7的結(jié)合降解TGF-β受

5、體導(dǎo)致TGF-β信號通路的減弱，這與上述推論(Smurfs通過降解Smad7能夠放大TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腎纖維化發(fā)病機(jī)制中的生物學(xué)效應(yīng))似乎存在矛盾。與Smurfs有所不同，另一E3泛素連接酶Arkadia對TGF-β受體并無降解作用，它可以直接降解Smad7從而達(dá)到放大TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路生物學(xué)效應(yīng)的作用。鑒于Arkadia介導(dǎo)Smad7的降解作用具有相對特異性，探討二者在腎小管間質(zhì)纖維化以及與此密切關(guān)聯(lián)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過

6、程中的相互作用及其機(jī)制對腎纖維化的防治具有一定的理論意義。 第一章 Arkadia-Smad7介導(dǎo)TGF-β信號通路的正向調(diào)控與腎小管間質(zhì)纖維化的關(guān)系 目的:利用UUO大鼠模型，初步探討腎小管間質(zhì)纖維化過程中Arkadia、Smurf2、Smad7及TβRI等信號分子在TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相互作用關(guān)系及其表達(dá)變化。 方法:SD大鼠隨機(jī)分為模型組和假手術(shù)組(sham組)，模型組每組6只：UUO術(shù)后3天

7、組、UUO術(shù)后7天組、UUO術(shù)后14天組及UUO術(shù)后28天組；假手術(shù)組每組4只。采用單側(cè)(左)輸尿管結(jié)扎方法，建立梗阻性腎小管間質(zhì)纖維化大鼠模型，Sham組只游離輸尿管而不結(jié)扎。分別于術(shù)后3天、7天、14天、28天處死動物，取結(jié)扎側(cè)腎臟；同時處死假手術(shù)組大鼠，取出腎組織。觀察各組間腎臟病理學(xué)變化，采用免疫組化、Western-blot、RT-PCR及免疫共沉淀等方法檢測Arkadia、Smurfs與Smad7、TβRI等表達(dá)變化及其相互

8、作用關(guān)系。 結(jié)果:光鏡下假手術(shù)組大鼠腎組織無明顯變化，模型組大鼠隨著輸尿管結(jié)扎時間的延長，其腎組織逐漸出現(xiàn)腎小管進(jìn)行性擴(kuò)張、彌漫性炎癥細(xì)胞浸潤，間質(zhì)面積增寬、部分腎小管萎縮、腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變性，最終出現(xiàn)腎小管結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，代之以浸潤的炎性細(xì)胞和彌漫增生的纖維組織。 與假手術(shù)組相比，RT-PCR顯示模型組大鼠腎組織中Col-1 mRNA及TGF-β1 mRNA的表達(dá)隨梗阻時間延長而逐漸增強(qiáng)；與假手術(shù)組相比，Wes

9、tem Blot及RT-PCR均顯示模型組大鼠腎組織中Arkadia及其mRNA表達(dá)逐漸增強(qiáng)；與假手術(shù)組相比，RT-PCR顯示模型組大鼠腎組織中Smad7 mRNA表達(dá)逐漸增強(qiáng)，而免疫組化及Westem Blot則顯示模型組大鼠腎組織中Smad7蛋白質(zhì)表達(dá)逐漸較弱；與假手術(shù)組相比，Westem Blot顯示模型組大鼠腎組織中Smurf2、TβRI蛋白質(zhì)表達(dá)逐漸增強(qiáng)。 免疫共沉淀顯示，用Smad7抗體沉淀后，用相應(yīng)的抗體行West

10、ernBlot檢測顯示Arkadia-Smad7復(fù)合物、Smurf2-Smad7復(fù)合物及TβRI-Smad7復(fù)合物在模型組及假手術(shù)組大鼠腎組織中均有表達(dá)。用TβRI抗體沉淀后，用相應(yīng)的抗體行Western Blot檢測顯示Arkadia-TβRI復(fù)合物在模型組及假手術(shù)組大鼠腎組織中均無表達(dá)；Smurf2-TβRI復(fù)合物、Smad7-TβRI復(fù)合物在模型組及假手術(shù)組大鼠腎組織中均有表達(dá)。 結(jié)論: Arkadia-Smad7介導(dǎo)TG

11、F-β信號通路的正向調(diào)控在一定程度上促進(jìn)了腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展。 第二章 Arkadia-Smad7介導(dǎo)TGF-β信號通路的正向調(diào)控與腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的關(guān)系 目的:通過觀察Arkadia-siRNA及蛋白酶體抑制劑(Lactacystin)對Smad7的影響及由此所致的TGF-β<,1>誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程變化，借以探討Arkadia和Smad7在腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中相互作用及其基本機(jī)制。

12、 方法:常規(guī)培養(yǎng)正常人腎小管上皮細(xì)胞(HKC)，用TGF-β<,1>對HKC細(xì)胞進(jìn)行刺激，在此過程中分別用Arkadia-siRNA、Smurf2-siRNA及Lactacystin對HKC細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理。采用Western-blot、RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫共沉淀方法分別檢測Arkadia、Smurfs與Smad7、TβRI等信號分子及腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化代表性物質(zhì)(α-SMA、E-cadherin)及Col-I在HKC細(xì)胞中

13、的表達(dá)變化及其相互作用關(guān)系。 結(jié)果:與對照HKC相比，RT-PCR和Western Blot均顯示，TGF-β<,1>干預(yù)能夠使Arkadia及其mRNA在HKC中表達(dá)上調(diào)；與對照HKC相比，RT-PCR顯示，TGF-β<,1>干預(yù)能夠使Smad7 mRNA在HKC中表達(dá)上調(diào)，而Western Blot則顯示，TGF-β<,1>干預(yù)能夠使Smad7蛋白在HKC中表達(dá)下調(diào)；與對照HKC相比，Western Blot均顯示，TGF-

14、β<,1>干預(yù)能夠使Smurf2及Tp砒蛋白質(zhì)在HKC中表達(dá)上調(diào)。 免疫共沉淀顯示，用Smad7抗體沉淀后，用相應(yīng)抗體行WesternBlot檢測顯示，Arkadia-Smad7復(fù)合物、Smurf2-Smad7復(fù)合物及TβRI-Smad7復(fù)合物在TGF-β<,1>刺激HKC及未刺激HKC中均有表達(dá)。用TβRI抗體沉淀后，用相應(yīng)抗體行Western Blot檢測顯示，Arkadia-TβRI復(fù)合物在刺激組及對照組HKC中均無表達(dá)；

15、Smurf2-TβRI復(fù)合物及Smad7-TβRI復(fù)合物在刺激組及對照組HKC中均有表達(dá)。 RT-PCR和Western Blot均顯示，Arkadia-siRNA能夠顯著抑制TGF-β<,1>對Arkadia的誘導(dǎo)表達(dá)作用。與TGF-β<,1>刺激HKC組相比，RT-PCR顯示，Arkadia-siRNA及Lactacystin對TGF-β<,1>誘導(dǎo)Smad7mRNA的減少無明顯影響；Western Blot及免疫細(xì)胞化學(xué)顯示，Ar

16、kadia-siRNA及Lactacystin均可部分上調(diào)TGF-β<,1>對Smad7蛋白表達(dá)的減少作用。與TGF-β<,1>刺激HKC組相比，Western Blot顯示，Smurf2-siRNA及Lactacystin的干預(yù)均能使TGF-β<,1>對HKC中Smurf2蛋白的誘導(dǎo)作用受到抑制；Lactacystin能夠上調(diào)TGF-β<,1>對Smad7蛋白的減少作用，而Smurf2-siRNA則無此作用。Western Blot顯

17、示，Lactacystin能夠下調(diào)TGF-β<,1>對HKC中TβRI蛋白的誘導(dǎo)作用，而Arkadia-siRNA則對HKC中TβRI蛋白表達(dá)無明顯影響。 RT-PCR和Western Blot均顯示，TGF-β<,1>干預(yù)能夠使HKC中Col-1及其mRNA、α-SMA及其mRNA的表達(dá)逐漸上調(diào)，使E-cadherin及其mRNA的表達(dá)減弱，Arkadia-siRNA及Lactacystin則能夠部分逆轉(zhuǎn)TGF-β<,1>的上