Smad2通過抑制TGF-β1-Smad3介導(dǎo)的膠原合成在肝纖維化中起保護(hù)作用.pdf

1、肝纖維化(fibrosis of liver)是由各種慢性肝病發(fā)展到肝硬化、肝癌的中間必經(jīng)階段，主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)(extracelluar matrix，ECM)在肝內(nèi)的大量沉積，并由此導(dǎo)致肝臟功能損傷。其中膠原是ECM的主要來(lái)源是，抑制膠原的合成能夠減慢肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。
　　TGF-β1是公認(rèn)的調(diào)控肝纖維化形成的因子，在肝纖維化疾病過程中，TGF-β1激活HSC，促使ECM產(chǎn)生，同時(shí)會(huì)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶，使膠原降解減少

2、，逐漸加重肝纖維化。Smad2和Smad3作為TGF-β信號(hào)下傳的主要效應(yīng)分子，結(jié)構(gòu)上相似，但功能呈多樣化。在肝纖維化中，Smad3是致病性的，而Smad2所扮演的具體角色還不確定。本研究采用皮下注射50％CCl4植物油溶液（1ml/kg）12周建立大鼠肝纖維化模型，TGF-β1刺激人肝星狀細(xì)胞株LX-2為細(xì)胞模型，采用激光共聚焦、分子生物學(xué)、明膠酶譜等手段檢測(cè)肝纖維化病程中Smad2和Smad3的表達(dá)變化。
　?。?）Smad2

3、和Smad3在肝星狀細(xì)胞中表達(dá)
　　采用CCl4皮下注射SD大鼠12周，復(fù)制模型。HE和Masson染色結(jié)果顯示模型組大鼠肝組織出現(xiàn)肝纖維化的病理變化；Western blot和PCR檢測(cè)Col.I的表達(dá)發(fā)現(xiàn)Col.I在模型組明顯升高，表明大鼠肝纖維化進(jìn)展期模型建立完成。同時(shí)免疫熒光對(duì)α-SMA和p-Smad2，α-SMA和p-Smad3進(jìn)行雙染，顯示p-Smad2和p-Smad3在肝星狀細(xì)胞有表達(dá)，Western blot檢測(cè)p

4、-Smad2和p-Smad3在進(jìn)展期表達(dá)均升高。
　?。?）采用小干擾RNA技術(shù)沉默Smad2和Smad3。細(xì)胞株中沉默Smad2基因后，Col.I表達(dá)明顯上升與正常組相比，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2及其抑制劑TIMP-1的平衡被打破，MMP-2降低，TIMP-1升高，提示Smad2沉默后基質(zhì)的生成增多，降解減少。而Smad3基因沉默后Col.I生成減少；
　?。?）過表達(dá)Smad2后Col.I和TIMP-1表達(dá)降低，但MMP

5、-2升高，提示Smad2過表達(dá)后基質(zhì)的生成減少，降解增多。Smad3基因過表達(dá)后結(jié)果相反；（4）Smad2抑制了Smad3的磷酸化及核轉(zhuǎn)位，這可能是Smad2抑制Smad3介導(dǎo)的的纖維化的機(jī)制所在。
　　采用免疫熒光檢測(cè)Smad2沉默后P-Smad3的核轉(zhuǎn)位情況。沉默Smad2后P-Smad3的核轉(zhuǎn)位增加。Western blot檢測(cè)沉默Smad2后P-Smad3的表達(dá)增加,過表達(dá)Smad2后P-Smad3的表達(dá)降低。