MicroRNA-145通過下調(diào)Smad3抑制TGF-β介導的非小細胞肺癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化.pdf

1、目的：肺癌是世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡率的首要原因，其中，非小細胞肺癌（NSCLC）占其各類型的大多數(shù)，約85％。肺癌早期癥狀并不明顯，同時早期診斷標記物及其他有效診斷手段缺乏，導致大多數(shù)患者在明確診斷時已處于中晚期。
　　上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指具有極性的上皮細胞在特定的生理或病理情況下向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的生物學過程。近些年，EMT在癌癥研究中早已引起關(guān)注，并且越

2、來越多的證據(jù)表明，EMT在人類惡性腫瘤細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用。
　　轉(zhuǎn)化生長因子-β（Transforming growth factor beta，TGF-β）是一類具有多種功能的細胞因子，其調(diào)控著多樣的生理功能，如細胞增殖、分化、凋亡以及EMT。其中TGF-β介導的EMT促進腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲。TGF-β信號通路本身的異常也可能引起人類腫瘤，它主要通過Smad或非Smad信號通路行使其生物學功能。
　　研究顯示Sma

3、d3作為TGF-β信號通路中一個重要的組成部分，它對于TGF-β介導的EMT、腫瘤抑制以及轉(zhuǎn)移極其重要。Smad3依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)控制著大部分的TGF-β靶向基因。研究顯示Smad3可通過其介導的EMT加速腫瘤細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。Smad3本身并不具備上述能力，而是通過其磷酸化形式發(fā)揮作用，后者進入細胞核調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。
　　MicroRNAs（MiRNAs）是一類由19到24個核苷酸組成的短鏈非編碼RNAs，其調(diào)節(jié)著基因的表達，并

4、且通過翻譯抑制或下調(diào)靶基因的mRNA來影響蛋白質(zhì)的翻譯或影響mRNA的穩(wěn)定性。MiRNAs在基本的生物學過程中發(fā)揮作用，如細胞分化、增值、生存和死亡。其異常表達涉及腫瘤進程的各方面，如腫瘤發(fā)生、凋亡抑制、腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移。報道顯示miR-145在多種腫瘤細胞中扮演著腫瘤抑制的作用。
　　本課題探討了miR-145和Smad3在NSCLC中的表達水平，miR-145與 Smad3相互作用的潛在機制，以及它們在TGF-β1介導的EMT中

5、的作用。為NSCLC的早期診斷和靶向治療提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.預測并驗證miR-145的直接靶向結(jié)合基因Smad3
　　運用預測軟件TargetScan、PicTar和mirBase查找、預測miR-145的靶基因Smad3。同時查找miR-145的成熟體序列、并合成miR-145的模擬體mimics，瞬時轉(zhuǎn)染A549及95C細胞，通過實時熒光定量PCR（qPCR）的方法檢測轉(zhuǎn)染前后Smad3 mRNA的

6、表達變化；利用Western blot檢測Smad3蛋白的表達變化；最后通過雙熒光素酶活性實驗驗證miR-145是否與Smad33’UTR區(qū)域的種子序列直接結(jié)合。
　　2.miR-145靶向調(diào)控Smad3引起NSCLC細胞的生物學功能變化
　　通過qPCR檢測臨床病人NSCLC組織和對應的癌旁組織中Smad3 mRNA和miR-145的相對表達量。qPCR和Western blot檢測包括人正常支氣管上皮細胞HBE在內(nèi)的6株

7、肺癌細胞（A549、H460、95D、95C和H1299）miR-145 mRNA、Smad3 mRNA和Smad3蛋白的相對表達量。用miR-145 mimics、inhibitor miR-145 mimics和Smad3-siRNA分別轉(zhuǎn)染A549及95C細胞；運用Western blot檢測上述細胞株Smad3、E-cadherin、N-cadherin的蛋白表達水平；通過Transwell試驗檢測上述基因?qū)SCLC細胞侵襲及

8、遷移的影響。
　　3.了解TGF-β1對上述生物學變化的影響
　　對上述轉(zhuǎn)染10h后的細胞加入TGF-β1，同樣方法檢測Smad3、p-Smad3、E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達變化，以及TGF-β1對NSCLC細胞侵襲及遷移的影響變化。
　　結(jié)果：
　　1.miR-145直接靶向結(jié)合Smad3-3’UTR區(qū)域，調(diào)控Smad3的蛋白表達量。
　　miR-145 mimics轉(zhuǎn)染NSCL

9、C細胞后，Smad3 mRNA及 Smad3蛋白表達量均較對照組明顯下降。熒光素酶活性實驗檢測證實了miR-145與Smad3-3’UTR區(qū)域的種子序列直接結(jié)合。
　　2.miR-145通過直接靶向調(diào)控Smad3引起NSCLC細胞的生物學功能變化。
　　在NSCLC組織中，Smad3 mRNA表達量較相應的癌旁組織明顯上升（P<0.05），而miR-145的表達量較癌旁組織明顯下降（P<0.01）。與HBE細胞株相比，Sma

10、d3 mRNA和蛋白表達水平在NSCLC細胞株中明顯上升，而miR-145 mRNA的表達量明顯下降。用miR-145 mimics和Smad3-siRNA瞬時轉(zhuǎn)染NSCLC細胞株，Western blot檢測顯示，相對于對照組，Smad3及N-cadherin蛋白表達量明顯下降、E-cadherin蛋白表達量明顯增加；侵襲和遷移實驗表明，與對照組相比，過表達miR-145或下調(diào)Smad3表達均能明顯抑制NSCLC細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。

11、而經(jīng)轉(zhuǎn)染inhibitor miR-145 mimics后的NSCLC細胞株則顯示了相反的蛋白結(jié)果和侵襲遷移結(jié)果。
　　3.TGF-β1增強 NSCLC細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。
　　轉(zhuǎn)染miR-145 mimics或Smad3-siRNA組，與相應的對照組相比，TGF-β1并未改變Smad3蛋白表達水平，但上調(diào)了p-Smad3和N-cadherin蛋白表達量、下調(diào)了E-cadherin蛋白表達量；與未加TGF-β1相比，侵襲及