MicroRNA-187調(diào)控多靶點(diǎn)通過參與TGFβ介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移.pdf

1、結(jié)直腸癌是一種嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，在我國發(fā)病率和死亡率均位居前五。
　　上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一，通過下調(diào)上皮標(biāo)志物E-鈣粘蛋白(E-cadherin)等，上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白(Vimentin)等，使細(xì)胞失去上皮極性，獲得更好的侵襲能力和運(yùn)動(dòng)能力，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)是EMT的重要調(diào)節(jié)因子，通過Sma

2、d依賴和非依賴途徑促進(jìn)腫瘤EMT。因此，TGFβ/EMT網(wǎng)絡(luò)可能是結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵機(jī)制。
　　研究目的：
　　本研究旨在探討miR-187及其靶基因SOX4、NT5E、PTK6如何參與TGFβ介導(dǎo)EMT的分子機(jī)制，為將來選擇性干預(yù)miR-187及其靶基因治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.miR-187在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)
　　2.miR-187對結(jié)直腸癌細(xì)胞體內(nèi)外生物學(xué)特性

3、的影響
　　3.miR-187參與TGFβ介導(dǎo)的EMT的機(jī)制研究
　　4.miR-187靶基因的篩選與鑒定
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　研究結(jié)果：
　　1.miR-187在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)
　　(1)miR-187在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)
　　在GEO(Gene Expression Omnibus，GSE49246)對結(jié)直腸癌組

4、織microRNA芯片進(jìn)行分析，在40對結(jié)直腸癌組織中，與癌旁正常組織相比，有32對癌組織中miR-187表達(dá)下調(diào)。熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，35對新鮮的結(jié)直腸癌組織與配對正常組織相比，miR-187在癌組織中表達(dá)低于正常配對組織(P＜0.05)，并且在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中，與未檢測到有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織相比，miR-187的表達(dá)更低(P=0.001)。與正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460相比，miR-187在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)(

5、P＜0.05)。
　　(2)miR-187與患者不良預(yù)后相關(guān)
　　通過對119例有完整隨訪資料的結(jié)直腸癌石蠟包埋組織進(jìn)行原位雜交檢測miR-187的表達(dá)，并結(jié)合患者臨床資料進(jìn)行臨床病理學(xué)參數(shù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，患者的性別、年齡、腫瘤的位置和大小、分化程度、及TNM分期與miR-187的表達(dá)均無關(guān)系(P=0.164; P=0.476; P=0.744; P=0.197; P=0.575; P=0.379; P=0.272;P=0.771

6、)。生存分析表明miR-187低表達(dá)與患者不良預(yù)后密切相關(guān)(P=0.016)，采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型評估臨床病理學(xué)參數(shù)與患者總生存期的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，患者總生存期與腫瘤分化程度、N及M分期、miR-187的表達(dá)有關(guān)(P＜0.005;P＜0.01;P=0.001，P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　以上實(shí)驗(yàn)說明，miR-187在結(jié)直腸癌中低表達(dá)，并與患者不良預(yù)后相關(guān)，有望作為獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)判斷結(jié)直腸癌患者的預(yù)后。
　　2.miR-

7、187抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞體內(nèi)外增殖、遷移、運(yùn)動(dòng)和體內(nèi)肺定植能力
　　(1)miR-187抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞體外增殖、遷移和運(yùn)動(dòng)能力
　　(2)miR-187抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞體內(nèi)增殖和肺定植能力
　　3.TGFβ調(diào)控miR-187激活Smad通路介導(dǎo)EMT的發(fā)生
　　(1)miR-187抑制EMT的發(fā)生
　　(2)miR-187參與TGFβ/Smad通路
　　4.miR-187靶向SOX4、NT5E、PTK

8、6
　　(1)miR-187相關(guān)靶基因的預(yù)測
　　對SW480、RKO細(xì)胞miR-187基因芯片結(jié)果結(jié)合生物信息在線網(wǎng)站TargetScan、Pictar和miRanda取交集預(yù)測出114個(gè)miR-187的候選靶基因，對這114個(gè)基因進(jìn)行基因本體分析及KEGG通路分析初步篩選出27個(gè)靶基因進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測，結(jié)果顯示SOX4、NT5E、PTK6在過表達(dá)miR-187的細(xì)胞中下調(diào)(t=5.798，P＜0.005; t

9、=3.783，P＜0.05; t=5.357; P＜0.01)。
　　(2)miR-187靶基因的鑒定
　　成功構(gòu)建wt SOX4/NT5E/PTK63'UTR和mut SOX4/NT5E/PTK63'UTR雙熒光素酶報(bào)告載體。將以上質(zhì)粒與對照質(zhì)粒psiCHECK-2分別與miR-187mimics共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后檢測熒光素酶活性，結(jié)果顯示psiCHECK-2+mimics熒光素酶相對活性分別為1.000±0.153，1

10、.000±0.222，1.000±0.151; wtSOX4/NT5E/PTK63'UTR+ mimics熒光素酶相對活性分別為0.634±0.054，0.456±0.032，0.627±0.015; mut SOX4/NT5E/PTK63'UTR+ mimics熒光素酶相對活性分別為0.957±0.176，0.806±0.088，0.928±0.198，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.306，P＜0.05; F=11.737，P＜0.0

11、1;F=9.080，P＜0.05)。對照質(zhì)粒psiCHECK-2與突變質(zhì)粒mut SOX4/NT5E/PTK63'UTR與miR-187共轉(zhuǎn)染均沒有改變熒光素酶的活性，表明miR-187與SOX4/NT5E/PTK63'UTR可特異性結(jié)合。Western Blot和免疫熒光結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-187后SOX4、NT5E、PTK6表達(dá)下調(diào)。
　　(3)miR-187靶基因的功能與機(jī)制
　　在SW480/LV-miR-187

12、和RKO/LV-miR-187細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)入SOX4、NT5E、PTK6的ORF克隆載體，Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Mock組、control組、mimics組、mimics+SOX4組、mimics+NT5E組、mimics+PTK6組細(xì)胞的遷移能力具有顯著差異(F=29.368，P＜0.001;F=44.690，P＜0.001)。多重結(jié)果比較表明，過表達(dá)miR-187使SW480和RKO細(xì)胞體外遷移能力降低(P＜0.0

13、01;P＜0.001)，恢復(fù)靶基因SOX4、NT5E、PTK6的表達(dá)后SW480和RKO細(xì)胞體外遷移能力得到恢復(fù)(P=0.001，P＜0.001，P＜0.001;P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001)。
　　在SW480和RKO細(xì)胞中進(jìn)行如下轉(zhuǎn)染處理: mock、control、miR-187mimics、miR-187 mimics+SOX4/NT5E/PTK6共轉(zhuǎn)染，48h后收細(xì)胞進(jìn)行WesternBlot，結(jié)果顯示

14、單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-187 mimics后EMT上皮標(biāo)志物(E-cadherin，β-catenin)表達(dá)增加，間質(zhì)標(biāo)志物(fibronectin，vimentin)表達(dá)降低，Smad信號通路被制;與單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-187 mimics相比，miR-187 mimics+SOX4/NT5E/PTK6共轉(zhuǎn)染組EMT上皮標(biāo)志物(E-cadherin，β-catenin)表達(dá)降低，間質(zhì)標(biāo)志物（fibronectin，vimentin）表達(dá)增加，S

15、mad信號通路活化，miR-187抑制EMT及Smad通路的作用被部分逆轉(zhuǎn)。
　　研究結(jié)論：
　　1、miR-187在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，與患者不良預(yù)后密切相關(guān)，初步推斷miR-187在結(jié)直腸癌中扮演著抑癌基因的作用;
　　2、miR-187抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞體內(nèi)外增殖、遷移、運(yùn)動(dòng)和肺定植能力;
　　3、TGFβ調(diào)控miR-187激活Smad通路介導(dǎo)EMT;
　　4、miR-187靶向SOX4、NT5