MiR-196a通過調節(jié)上皮-間質轉化促進人結直腸癌細胞轉移.pdf

1、背景：
　　越來越多的證據(jù)表明,microRNA(miRNA)在腫瘤轉移中通過調節(jié)上皮-間質轉化(EMT)過程發(fā)揮了關鍵作用。我們通過qRT-PCR檢測時發(fā)現(xiàn)miR-196a在人類結直腸癌(CRC)細胞和結直腸癌組織中呈高表達。wound healing和cell migration assays實驗表明miR-196a促進結直腸癌細胞轉移,而miR-196a-in呈現(xiàn)相反的效果。與EMT相關的E-鈣粘蛋白(E-cadherin)

2、、α-鈣粘蛋白(α-catenin)和波形蛋白(vimentin)采用qRT-PCR和 Western-Blots分析發(fā)現(xiàn)miR-196a上調波形蛋白的表達并下調E-cadherin和α-catenin表達?？傊?miR-196a通過調節(jié)EMT促進了結直腸癌細胞的轉移。
　　研究目的：
　　通過利用qRT-PCR方法來檢測結直腸癌細胞株、結直腸癌組織及癌旁組織中miR-196a的表達情況,選擇適當?shù)慕Y直腸癌細胞株進行質粒轉染

3、并設置對照實驗組,進一步通過qRT-PCR、woundhealing、cell migration方法證實miR-196a在結直腸癌細胞中呈高表達并能促進結直腸癌細胞轉移。利用qRT-PCR和Western-blots實驗分別觀察EMT相關的E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、α-粘蛋白(α-catenin)和波形蛋白(vimentin)表達情況,分析miR-196a是否調節(jié)了EMT過程。
　　研究方法：
　　1.通過qR

4、T-PCR技術檢測八對結直腸癌及癌旁組織，以及3種結直腸癌細胞株（HT-29、SW620、SW480）的miR-196a表達情況,根據(jù)檢測結果選擇相應結直腸癌細胞株進行細胞培養(yǎng)。
　　2.將已經(jīng)選擇的結直腸癌細胞株進行質粒轉染(miR-196a-in、miR-196a)及相應的陰性對照組(NC)和(NC-in),共計4組并繼續(xù)培養(yǎng)。
　　3.Wound healing細胞劃痕實驗,觀察4組細胞遷移移動距離,在顯微鏡下進行拍攝

5、,利用Pro Plus6圖像軟件進行分析。
　　4.Migration assays遷移分析,采用Transwell膜進行遷移實驗,觀察染色細胞在顯微鏡下活動并計數(shù)。
　　5.Western-blots免疫印跡實驗,用β-actin(β肌動蛋白)作為內(nèi)參檢測E-cadherin、vimentin及α-catenin情況并進行分析。
　　統(tǒng)計分析
　　所有統(tǒng)計的數(shù)據(jù)均以平均±標準差(SD)表示,利用SPSS17軟件

6、進行統(tǒng)計處理。P值小于0.05被認為有顯著差異。
　　研究結果：
　　1.我們采用了qRT-PCR技術對8組結直腸癌組織(T)及癌旁組織(ANT)中的miR-196a表達量進行檢測發(fā)現(xiàn)：結直腸癌組織及癌旁組織中miR-196a表達差異性明(P＜0.05),T/ANT大于1。檢測結直腸癌細胞系中(HT-29、SW620和 SW480)通過qRT-PCR分析,結果表明：SW620結直腸癌細胞株中miR-196a表達量與HT-29

7、細胞株接近,明顯高于SW480細胞株,而且相比之下SW620細胞株容易獲的,鑒于上述結果,就決定用SW620繼續(xù)行細胞實驗。
　　2.MiR-196a能促進結直腸癌細胞轉移,將結直腸癌SW620細胞轉染miR-196a和miR-196a-in并與(NC)和(NC-in)組進行對照。Wound healing實驗證明SW620細胞轉染miR-196a后遷移距離最遠,與對照組相比差異性明顯(P＜0.05),與此相反的是SW620細胞株

8、轉染miR-196a-in后遷移距離最短,與對照組相比差異性明顯(P＜0.05)。此外,Migration assays實驗結果顯示,轉染miR-196a后SW620細胞遷移能力明顯提高,而miR-196a-in降低了細胞的遷移距離,在統(tǒng)計學上差異性明顯(P＜0.05)。總之,這些實驗結果表明：miR-196a過度表達會促進結直腸癌細胞的轉移。
　　3.MiR-196a上調vimentin的表達并且下調E-cadherin和α-c

9、arenin表達,我們確定了其機制的基礎為miR-196a通過調控EMT的相關的E-cadherin、vimentin和α-catenin實現(xiàn)的。RT-PCR顯示:miR-196a作用下vimentin中相應的MRNA表達最高,E-cadherin和α-carenin明顯減少(P＜0.05),Western blot結果顯示,miR-196a在減少E-cadherin和α-carenin表達同時而增加vimentin表達,miR-196