OCT4B1誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化而獲得干細(xì)胞特性的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　在前期研究中已證實(shí)OCT4B1誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT而獲得干細(xì)胞特性，本研究探討其調(diào)控機(jī)制。
　　方法：
　　在前期研究中已證實(shí)，通過(guò)懸浮培養(yǎng)的人結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞（SW480 CSCs）OCT4B1 mRNA水平較其親本細(xì)胞（SW480）明顯增高；采用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)沉默SW480 CSCs中OCT4B1基因（SW480 CSCs-RNAi）后，與陰性對(duì)照組（SW480 CSCs-NC）比較

2、，OCT4B1 mRNA水平明顯降低，本研究對(duì)上述四組細(xì)胞作如下檢測(cè)：
　　（1）用RT-qPCR法及Western blot檢測(cè)調(diào)控腫瘤EMT過(guò)程的指標(biāo)PLK1 mRNA及蛋白水平是否與OCT4B1呈相同趨勢(shì)變化；
　　（2）行miRNA芯片檢測(cè)，篩選與OCT4B1及PLK1變化趨勢(shì)相反，且與PLK1存在結(jié)合位點(diǎn)的miRNA；
　?。?）用RT-qPCR方法驗(yàn)證該miRNA在四組細(xì)胞中的表達(dá)是否與芯片檢測(cè)結(jié)果一致；<

3、br>　?。?）采用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)篩選的miRNA與PLK1是否存在直接調(diào)控作用。
　　結(jié)果：
　?。?）RT-qPCR檢測(cè)四組細(xì)胞PLK1 mRNA表達(dá)，SW480與SW480 CSCs相對(duì)水平分別為(1.00±0.13)及(3.22±0.10)，SW480 CSCs-NC與SW480 CSCs-RNAi相對(duì)水平分別為(1.99±0.17)及(0.92±0.09)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；Western

4、blot檢測(cè)PLK1蛋白表達(dá)，SW480與SW480 CSCs蛋白表達(dá)分別為（0.68±0.05）與（1.16±0.08），SW480 CSCs-NC與SW480 CSCs-RNAi蛋白表達(dá)分別為（1.50±0.11）與（0.27±0.06），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示PLK1與OCT4B1呈相同趨勢(shì)變化；
　?。?）miRNA芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-8064與OCT4B1及PLK1變化趨勢(shì)相反，通過(guò)生物信息學(xué)軟件Ta

5、rgetScan human分析發(fā)現(xiàn)它與PLK1存在結(jié)合位點(diǎn)；
　?。?）進(jìn)一步通過(guò)RT-qPCR證實(shí)miR-8064在四組細(xì)胞中表達(dá)，SW480與SW480 CSCs相對(duì)水平分別為(1.00±0.12)及(0.40±0.06)，SW480 CSCs-NC與SW480 CSCs-RNAi相對(duì)水平分別為(0.12±0.03)及(0.93±0.02)，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），發(fā)現(xiàn)在四組細(xì)胞中miR-8064表達(dá)與芯片檢測(cè)結(jié)果