塞來昔布誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景：卵巢癌是所有婦科惡性腫瘤中死亡率最高的疾病。上皮性卵巢癌(Epithelial Ovarian Cancer，EOC)患者占所有卵巢癌患者的90％[1]。由于多數(shù)上皮性卵巢癌在診斷時(shí)就已發(fā)展至晚期，即使聯(lián)合手術(shù)與先進(jìn)的化療藥物進(jìn)行治療，患者的五年生存率仍徘徊在30％左右[2]。上皮性卵巢癌患者高復(fù)發(fā)率和死亡率的主要原因是患者在診斷時(shí)就已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移。網(wǎng)膜、腹膜、膈肌及腸系膜等處的轉(zhuǎn)移已被證實(shí)是卵巢癌患者的不良預(yù)后因素[3]。因此闡明

2、卵巢癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制在改善卵巢癌患者的診斷、治療及預(yù)后有著重要的意義。已有大量研究證實(shí)，炎癥參與了癌癥的發(fā)生發(fā)展[4]。環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)是一種在炎癥過程中誘導(dǎo)表達(dá)升高的酶，其主要作用是將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素[5]。同時(shí)環(huán)氧化酶-2在人類上皮性癌癥的侵襲、轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal Transition，EMT)的發(fā)生中起關(guān)鍵作用[6-8]。這些研究

3、均支持將選擇性環(huán)氧化酶-2抑制劑，非甾體類抗炎藥塞來昔布(Celecoxib)用于癌癥的治療。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)塞來昔布可以調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制血管生成[9]。在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、口腔黏膜癌前病變及上皮性卵巢癌的治療中，塞來昔布作為輔助用藥已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[10-13]。然而這些臨床試驗(yàn)并未證實(shí)塞來昔布可以改善癌癥患者的預(yù)后。盡管在一項(xiàng)針對45位復(fù)發(fā)性卵巢癌患者的臨床研究中患者對塞來昔布的治療反應(yīng)較好，但是在另一項(xiàng)151

4、位卵巢癌患者的臨床研究中，塞來昔布聯(lián)合多西紫杉醇和卡鉑的治療并未改善患者的無病生存期和總生存率[13，14]?？梢娙麃砦舨荚诼殉舶┑闹委熤写嬖跔幾h，其中的機(jī)制需要進(jìn)一步闡明。
　　目的：⑴研究塞來昔布作用于人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780和SKOV3后對細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖和細(xì)胞侵襲性的影響;⑵研究塞來昔布對卵巢癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)作用，檢測塞來昔布作用前后上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平;⑶探討ZEB1表達(dá)在塞來昔布誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)

5、生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用，研究塞來昔布誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制。
　　方法：①M(fèi)TT法檢測不同濃度塞來昔布(0，5，10，15μM)對A2780和SKOV3的生長抑制作用;②相差倒置顯微鏡觀察塞來昔布(10μM)對A2780和SKOV3細(xì)胞形態(tài)的改變并拍攝照片;③Transwell侵襲小室檢測塞來昔布(10μM)對A2780和SKOV3細(xì)胞侵襲性的影響，在相差倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)粘附于侵襲小室底部的細(xì)胞數(shù);④蛋白印跡法檢測塞來

6、昔布(0，5，10，15μM)作用前后A2780和SKOV3細(xì)胞中上皮表型E-cadherin和Keratin、間質(zhì)表型N-cadherin和Vimentin以及p-AKT、p-ERK和ZEB1表達(dá)的變化;⑤ZEB1小干擾NRA(Small-interfering RNA，siRNA)作用于A2780和SKOV3細(xì)胞后再檢塞來昔布對細(xì)胞的侵襲能力的影響和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)作用。
　　結(jié)果：⑴塞來昔布對卵巢癌細(xì)胞生長抑制作用的研究:

7、應(yīng)用MTT法檢測不同濃度塞來昔布（0，5，10，15μM）作用于A2780和SKOV3細(xì)胞，48小時(shí)后檢測塞來昔布對細(xì)胞的增殖的抑制情況，結(jié)果顯示:與對照組相比，各濃度組均未對細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用(P.0.05)。⑵塞來昔布對卵巢癌細(xì)胞形態(tài)影響的研究:應(yīng)用相差倒置顯微鏡觀察塞來昔布(10μM)對細(xì)胞形態(tài)的改變，結(jié)果顯示:A2780細(xì)胞的空白對照組細(xì)胞呈現(xiàn)較規(guī)則的小三角形的上皮細(xì)胞形態(tài)，而實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞則出現(xiàn)伸長呈現(xiàn)梭行改變;而本身形

8、態(tài)就不規(guī)則的SKOV3細(xì)胞形態(tài)逐漸變得規(guī)則清晰，并伸展出較長觸角。⑶塞來昔布對卵巢癌細(xì)胞侵襲性影響的研究:應(yīng)用Transwell侵襲小室檢測塞來昔布(10μM)對A2780和SKOV3細(xì)胞侵襲性的改變，結(jié)果顯示:與對照組相比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的侵襲性明顯增加(P≤0.001)。⑷塞來昔布誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制的研究:應(yīng)用蛋白免疫印跡方法檢測塞來昔布（0，5，10，15μM）對A2780和SKOV3細(xì)胞上皮E-cadherin、

9、Keratin和間質(zhì)表型N-cadherin、Vimentin以及p-AKT、p-ERK和ZEB1表達(dá)的影響，結(jié)果顯示:與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組的上皮表型E-cadherin和Keratin表達(dá)明顯降低，而間質(zhì)表型N-cadherin和Vimentin表達(dá)則明顯升高，并且隨著藥物濃度的增加表型表達(dá)變化越明顯;實(shí)驗(yàn)組p-AKT、p-ERK和ZEB1表達(dá)也隨著藥物濃度的增加逐漸增加。⑸塞來昔布促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制的確認(rèn):在加

10、入塞來昔布前應(yīng)用ZEB1小干擾NRA(Small-interfering RNA，siRNA)預(yù)先干擾A2780和SKOV3細(xì)胞，結(jié)果顯示:干擾掉ZEB1的細(xì)胞再加入塞來昔布(10μM)并不能增加細(xì)胞的侵襲性，也不能使細(xì)胞的上皮及間質(zhì)的表型表達(dá)發(fā)生改變。
　　結(jié)論：①塞來昔布能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變，使細(xì)胞逐漸變得細(xì)長呈現(xiàn)出間質(zhì)樣細(xì)胞的形態(tài);能夠明顯增加卵巢癌細(xì)胞的侵襲性;②塞來昔布能夠明顯促進(jìn)人卵巢癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，且具有