Notch通路在TGF-β1誘導(dǎo)上皮性卵巢癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用.pdf

1、目的:
　　 上皮性卵巢癌為最常見的卵巢惡性腫瘤，其死亡率居?jì)D科惡性腫瘤首位。卵巢癌早期不易發(fā)現(xiàn)，一旦出現(xiàn)癥狀多屬晚期（Ⅲ-Ⅳ期），存在廣泛轉(zhuǎn)移。雖經(jīng)過規(guī)范化治療包括理想的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和以鉑類和/或紫杉醇為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療，上皮性卵巢癌的5年生存率仍徘徊在30％-40％。卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生和對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性是造成其高死亡率的兩個(gè)關(guān)鍵因素。
　　 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransi

2、tion，EMT)是一個(gè)高度保守的細(xì)胞程序，是指上皮細(xì)胞失去上皮特性獲得間質(zhì)細(xì)胞表型的一種生物學(xué)現(xiàn)象。它不僅是哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育和器官形成的基礎(chǔ)過程，還是腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。并且越來越多的研究表明，腫瘤細(xì)胞經(jīng)過EMT，可以獲得多向分化等干細(xì)胞樣特性，與腫瘤對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥相關(guān)。因此通過各種技術(shù)和策略干擾腫瘤細(xì)胞的EMT過程有望為癌癥治療提供一個(gè)新途徑，但這有賴于對(duì)EMT分子調(diào)控機(jī)制以及腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。

3、　　 轉(zhuǎn)化生長因子β(transforminggrowthfactor-β，TGF-β)是一種分泌型的多肽信號(hào)分子，在多種腫瘤組織中呈高表達(dá)，其作為EMT的一個(gè)重要誘導(dǎo)因子，以自分泌和旁分泌的形式作用于腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)和維持細(xì)胞的EMT。研究發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生完全EMT轉(zhuǎn)換過程中，TGF-β需要干細(xì)胞信號(hào)通路如Notch，Wnt/β-catenin，Ras，Hedgehog等的介導(dǎo)，這種現(xiàn)象的存在進(jìn)一步提示了EMT與腫瘤干細(xì)胞之間的某

4、種關(guān)聯(lián)性。但信號(hào)通路之間的串話具有環(huán)境依賴性，該現(xiàn)象在上皮性卵巢癌中的存在性和存在形式仍需要進(jìn)一步研究的證實(shí)。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)人卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞株SKOV3，以TGF-β1和Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT作為處理因素，旨在研究Notch信號(hào)通路在TGF-β1誘導(dǎo)上皮性卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT過程中的作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探索，以期為上皮性卵巢癌的治療提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 常規(guī)

5、培養(yǎng)人卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞株SKOV3，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，應(yīng)用無血清培養(yǎng)基同步化24h后，按加入刺激的不同分為空白對(duì)照組，TGF-β1組(10ng/ml)，DAPT組(Notch信號(hào)通路的抑制劑，10uM)，TGF-β1和DAPT聯(lián)合處理組(10ng/mlTGF-β1，10uMDAPT)，不同刺激均作用72h。
　　 1、倒置顯微鏡:應(yīng)用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。
　　 2、蛋白質(zhì)印跡（Westernblotti

6、ng）:應(yīng)用Westernblotting檢測上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物N-cadherin、Vimentin，Notch信號(hào)通路的激活形式NICD以及Notch信號(hào)通路的配體Jagged1的表達(dá)情況。
　　 3、細(xì)胞劃痕試驗(yàn):應(yīng)用劃痕試驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞的遷移能力，常規(guī)培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞，應(yīng)用無血清培養(yǎng)基同步24h后，先按照分組加入不同刺激作用48h后再做劃痕，劃痕時(shí)理想的細(xì)胞密度為形成細(xì)胞單層，觀察劃痕24h

7、后不同組間劃痕愈合情況的不同。
　　 4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR:待加入TGF-β1刺激48h和72h后提取細(xì)胞的總RNA，檢測Jagged1mRNA的表達(dá)量。
　　 5、應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　 結(jié)果:
　　 1、倒置相差顯微鏡下觀察正常培養(yǎng)的SKOV3細(xì)胞形態(tài)為典型的鋪路石樣，細(xì)胞排列規(guī)則緊湊，在TGF-β1作用72h后，細(xì)胞轉(zhuǎn)換成紡錘體形，形成明顯的細(xì)胞偽足，且細(xì)胞排列變松散;在

8、DAPT處理組、TGF-β1和DAPT聯(lián)合處理組，細(xì)胞形態(tài)均沒有明顯變化。
　　 2、Westernblotting結(jié)果:
　　 (1)經(jīng)10ng/ml的TGF-β1作用72h后，SKOV3細(xì)胞上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin（0.632±0.129）表達(dá)較對(duì)照組(1.000±0.000)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Vimentin和N-cadherin（3.067±2.394、1.31

9、9±0.243）表達(dá)升高，與對(duì)照組相比(1.000±0.000、1.000±0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);TGF-β1和DAPT聯(lián)合處理組細(xì)胞E-cadherin、Vimentin和N-cadherin的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組分別為(0.961±0.224、1.548±1.015、1.181±0.223)，與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
　　 (2)與對(duì)照組相比(1.000±0.002)，TGF-β1組細(xì)胞Notch

10、信號(hào)通路的激活形式NICD的表達(dá)升高(1.453±0.379)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而TGF-β1和DAPT聯(lián)合處理組細(xì)胞NICD的相對(duì)表達(dá)量為(0.540±0.318)，與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
　　 (3)與對(duì)照組相比(1.000±0.003)，TGF-β1組細(xì)胞Jagged1的表達(dá)明顯升高(1.514±0.151)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3、劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示，劃痕24h后，

11、TGF-β1組[(24980.18±1171.20)um2]劃痕愈合面積明顯大于對(duì)照組[(19758.01±2534.50)um2]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而TGF-β1和DAPT聯(lián)合處理組[(17703.40±1519.27)um2]劃痕愈合面積較對(duì)照組和TGF-β1組均變小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 4、RT-PCR結(jié)果顯示，經(jīng)TGF-β1作用48h和72h后，Jagged1的mRNA表達(dá)量分別為