TGF-β1誘導(dǎo)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞TE13發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及其參與放射抗性的分子機(jī)制.pdf

1、目的:以體外培養(yǎng)的食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株TE13為實驗對象，通過放射線反復(fù)照射篩選出的具有EMT樣表型的放射抗性細(xì)胞株TE13R120，并利用轉(zhuǎn)化生長因子-β1（Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1）誘導(dǎo)TE13細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)，建立EMT細(xì)胞模型。對TE13細(xì)胞株、EMT模型細(xì)胞和TE13R120細(xì)胞進(jìn)行Real-Tim

2、e PCR、Western blot、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測，測定這三株細(xì)胞株中神經(jīng)營養(yǎng)因子受體（neurotrophin receptor p75 interacting MAGEhomologue，NRAGE）基因的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)定位情況。探討食管癌細(xì)胞中NRAGE亞細(xì)胞定位在EMT與放射抗性形成中的作用，對深入研究食管癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為具有重要意義，為放射抗性造成的放療失敗提供一種新的思路和實驗依據(jù)，同時也為腫瘤治療提供了新的靶點。<

3、br>　　方法:人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株TE13常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后用于實驗。實驗分為三組:TE13細(xì)胞組、EMT細(xì)胞模型組、TE13R120細(xì)胞組，通過Real-Time PCR、Western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)三種實驗技術(shù)分別檢測NRAGE的mRNA表達(dá)情況及總蛋白、胞漿蛋白、胞核蛋白的表達(dá)情況。其中TE13R120細(xì)胞株經(jīng)過放射線反復(fù)照射篩選TE13累積劑量120Gy所得，通過細(xì)胞克隆形成實驗驗證其放射抗性。并通過

4、倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，通過Western blot、Real-Time PCR檢測EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin的蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)情況驗證EMT樣表型的存在。EMT細(xì)胞模型利用TGF-β1誘導(dǎo)TE13細(xì)胞株所得，并通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，Western blot、Real-TimePCR檢測EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin的蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)情況驗證是否誘導(dǎo)成功。

5、統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組之間的比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05即認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.建立放射抗性細(xì)胞株TE13R120，并驗證其放射抗性及存在EMT樣表型
　　建立TE13R120細(xì)胞后，進(jìn)行克隆形成實驗擬合細(xì)胞存活曲線，計算TE13及TE13R120細(xì)胞放射敏感性參數(shù)D0、Dq、N值和SF2，TE13細(xì)胞分別為:2.242、0.854、

6、1.465、0.538;TE13R120細(xì)胞分別為:2.499、1.991、2.219、0.734。
　　倒置顯微鏡下觀察對數(shù)生長期的單層細(xì)胞TE13細(xì)胞株和TE13R120細(xì)胞株形態(tài)學(xué)差異，TE13細(xì)胞株為不規(guī)則的多邊形，細(xì)胞間邊界不清，呈片狀生長;而TE13R120細(xì)胞株則細(xì)長呈梭行或紡錘形，細(xì)胞極性消失。Western blot檢測EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin的蛋白表達(dá)情況，TE13細(xì)胞組的E-ca

7、dherin表達(dá)（403.526±32.684）高于TE13R120細(xì)胞組（132.291±6.542）(P＜0.05);TE13細(xì)胞組的Vimentin表達(dá)（86.438±4.387）低于TE13R120細(xì)胞組（400.324±5.698）(P＜0.05)。Real-Time PCR檢測EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin的mRNA表達(dá)情況。TE13細(xì)胞組的E-cadherin表達(dá)（1.576±0.290）高于TE1

8、3R120細(xì)胞組（0.095±0.052）(P＜0.05);TE13細(xì)胞組的Vimentin表達(dá)(1.015±0.236)低于TE13R120細(xì)胞組（23.145±1.131）（P＜0.05）。
　　2.TGF-β1誘導(dǎo)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株TE13細(xì)胞發(fā)生EMT
　　取對數(shù)生長期的單層細(xì)胞于倒置顯微鏡下觀察，TGF-β1(10ng/ml)刺激TE13細(xì)胞株48h后發(fā)生的形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞由不規(guī)則的多邊形轉(zhuǎn)變?yōu)榧忓N形;細(xì)胞間的結(jié)

9、合由緊密變?yōu)槭杷伞estern blot檢測EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin的蛋白表達(dá)情況，TE13細(xì)胞組的E-cadherin表達(dá)（403.526±32.684）高于EMT細(xì)胞模型組（156.369±5.722）(P＜0.05);TE13細(xì)胞組的Vimentin表達(dá)（86.438±4.387）低于EMT細(xì)胞模型組（389.324±9.378）(P＜0.05)。Real-Time PCR檢測EMT相關(guān)標(biāo)志物E-c

10、adherin、Vimentin的mRNA表達(dá)情況。TE13細(xì)胞組的E-cadherin表達(dá)（1.576±0.290）高于EMT細(xì)胞模型組（0.213±0.142）(P＜0.05); TE13細(xì)胞組的Vimentin表達(dá)（1.015±0.236）低于EMT細(xì)胞模型組(22.848±0.211)(P＜0.05)。
　　3.NRAGE在三組細(xì)胞中的表達(dá)情況
　　通過Real-Time PCR、Western blot、免疫細(xì)胞化

11、學(xué)技術(shù)對NRAGE在TE13細(xì)胞組、EMT細(xì)胞模型組、TE13R120細(xì)胞組中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測。Real-Time PCR檢測NRAGE的mRNA表達(dá)情況，TE13細(xì)胞組（1.6826±0.749）分別低于EMT細(xì)胞模型組(5.253±0.916)(P＜0.05)和TE13R120細(xì)胞組（5.562±2.212）(P＜0.05);EMT細(xì)胞模型組與TE13R120細(xì)胞組之間無差別(P＞0.05)。Western blot檢測NRAGE

12、的蛋白表達(dá)情況，TE13細(xì)胞組(34.408±3.267)分別低于EMT細(xì)胞模型組（160.327±15.797）（P＜0.05）和TE13R120細(xì)胞組(163.472±13.583)(P＜0.05);EMT細(xì)胞模型組與TE13R120細(xì)胞組之間無差別(P＞0.05)。進(jìn)一步運用Western blot檢測NRAGE在胞漿和胞核中蛋白表達(dá)情況。通過對三組細(xì)胞胞漿中NRAGE蛋白表達(dá)情況進(jìn)行兩兩比較，三者比較均無差別(P(TE13 VS

13、.EMT)＞0.05、P(TE13 VS.TE13R120)＞0.05、P(TE13R120 VS.EMT)＞0.05);兩兩比較在胞核中表達(dá)情況是否存在差別:TE13細(xì)胞組（45.384±3.680）分別低于EMT細(xì)胞模型組（198.345±26.265）和TE13R120細(xì)胞組（210.589±30.211），且均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P(TE13 VS.EMT)＜0.05、P(TE13 VS.TE13R120)＜0.05），EMT細(xì)胞模

14、型組與TE13R120細(xì)胞組間則無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測NRAGE在三組細(xì)胞中定位及胞漿胞核表達(dá)情況，三組細(xì)胞胞漿中的表達(dá)情況無明顯差別(P(TE13 VS.EMT)＞0.05、P(TE13 VS.TE13R120)＞0.05、P(TE13R120 VS.EMT)＞0.05)，胞核中EMT細(xì)胞模型組和TE13R120細(xì)胞組表達(dá)明顯多于TE13細(xì)胞組(P(TE13 VS.EMT)＜0.05、P(TE13 VS.TE1