缺氧對食管鱗癌細(xì)胞IL-6、TGF-β1的影響及間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用.pdf

1、研究背景：
　　我國在世界上食管癌的發(fā)病率、死亡率均居首位。在食管癌發(fā)生的早期，癌細(xì)胞對周圍組織的侵襲以及向鄰近、遠(yuǎn)端淋巴結(jié)、器官的轉(zhuǎn)移成為了食管癌患者難以治愈和遠(yuǎn)期死亡率居高不下的關(guān)鍵。因此，對于惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移機制的進(jìn)一步研究，闡明引起食管癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移發(fā)生的基因調(diào)控及蛋白分子作用機制，以開發(fā)出抑制或終結(jié)此過程的特效藥物成為當(dāng)前世界醫(yī)學(xué)界研究的熱點課題。
　　腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致惡性腫瘤復(fù)發(fā)和難以根治的重要原因，此過程貫穿于

2、組織病理的各個階段，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）在整個進(jìn)展過程中起到潛在的重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，EMT在胚胎發(fā)育、組織器官的形成、機體損傷修復(fù)、器官纖維化等過程中均扮演著關(guān)鍵角色。另外，EMT過程也是腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移過程中的一個重要事件。眾多的細(xì)胞內(nèi)外信號傳導(dǎo)通路參與了EMT過程，涉及到眾多基因的表達(dá)變化，如STAT3信號通路、Snail信號通路、Wnt通路等是與EMT的發(fā)生

3、相關(guān)的最為經(jīng)典細(xì)胞分子信號通路。
　　近年來，大量研究表明缺氧相關(guān)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在EMT的發(fā)生過程中也起到非常顯著的作用。缺氧誘導(dǎo)因子1（Hypoxia inducible factor-1，HIF-1）在肝癌、乳腺癌、胃癌以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤等多種惡性實體腫瘤中普遍存在，但在常氧條件下均會經(jīng)細(xì)胞內(nèi)氧依賴性泛素蛋白酶降解途徑降解，只有當(dāng)實體腫瘤生長到一定程度之時，腫瘤細(xì)胞的生長失去控制，最終腫瘤組織將會處在相對缺氧微環(huán)境當(dāng)中，HI

4、F-1方可穩(wěn)定表達(dá)。HIF-1α是HIF-1的活性亞基，受缺氧信號誘導(dǎo)調(diào)控，必須與HIF-1β結(jié)合形成穩(wěn)定的異源二聚體才能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用。當(dāng)腫瘤細(xì)胞缺氧發(fā)生時，HIF-1α在基因與蛋白水平的高表達(dá)，同時伴隨E-cadherin的下調(diào)和Vimentin的上調(diào)，這種現(xiàn)象在多種實體腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程中已被證實。近年來，眾多學(xué)者在對由HIF-1α介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)研究中取得了巨大進(jìn)展。
　　白介素-6（Interleukin-6

5、,IL-6）是一種由單核/巨噬細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、B/T淋巴細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞產(chǎn)生的多功能細(xì)胞因子，能夠刺激參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞增殖、分化以增強其功能，參與了機體的免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)以及機體造血等多種生理、病理過程。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌、前列腺癌、肺癌等多種實體腫瘤組織中IL-6也高表達(dá)，在腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等過程中起重要作用。IL-6的高表達(dá)可以通過IL-6/GPl30受體系統(tǒng)顯著激活STAT3，從而調(diào)控STAT3下游基因的表達(dá)

6、，引起上皮源性腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)間質(zhì)轉(zhuǎn)化。
　　轉(zhuǎn)化生長因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）廣泛存在于從果蠅到人多種生物的各種組織中，對正常細(xì)胞、癌變細(xì)胞的生長、分化均具有顯著調(diào)節(jié)作用。人類TGF-β有TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3三種亞型，其中TGF-β1在體細(xì)胞中的表達(dá)量最高，在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、機體炎癥反應(yīng)以及腫瘤發(fā)生、進(jìn)展等多種生理、病理過程中起著重要作用。目前，在TGF-

7、β與原癌基因表達(dá)關(guān)系中TGF-β1被認(rèn)為作用最為重要，在眾多TGF-β1誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的實體腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的研究中，發(fā)現(xiàn)TGF-β1是引起上皮源性實體腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT作用最為強烈，效果最為顯著的細(xì)胞外作用因子之一。
　　既往研究腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT時需添加外源性的TGF-β1、IL-6進(jìn)行刺激，而誘導(dǎo)完成后細(xì)胞可以通過自分泌TGF-β1、IL-6來維持EMT狀態(tài)。本實驗室之前研究發(fā)現(xiàn)，缺氧能夠成功誘導(dǎo)食管癌Eca-109細(xì)胞發(fā)生

8、EMT。此外，還發(fā)現(xiàn)使用外源性的TGF-β1、IL-6對體外培養(yǎng)的食管鱗癌EC-1細(xì)胞進(jìn)行刺激，成功誘導(dǎo)該細(xì)胞發(fā)生了EMT，推測在缺氧條件下食管癌細(xì)胞發(fā)生的EMT轉(zhuǎn)化的過程，可能與其產(chǎn)生和分泌更多的TGF-β1及IL-6相關(guān)。本次研究過程中采用科學(xué)的研究方法建立了食管鱗癌Eca-109細(xì)胞的體外培養(yǎng)化學(xué)性缺氧模型，阻斷了HIF-1α基因的表達(dá)；對缺氧條件下TGF-β1、IL-6的mRNA表達(dá)水平和蛋白分泌量的變化進(jìn)行了檢測，同時檢測了缺

9、氧對EMT相關(guān)基因E-cadherin、Vimentin mRNA與蛋白表達(dá)水平的影響；最后，對HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染后食管鱗癌Eca-109細(xì)胞體外遷移和侵襲能力的變化進(jìn)行了檢測。
　　第一部分細(xì)胞缺氧模型的建立及HIF-1α基因阻斷
　　研究方法：
　　1.調(diào)整培養(yǎng)液中CoCl2的終濃度為150μmol/L，培養(yǎng)食管鱗癌Eca-109細(xì)胞建立化學(xué)性細(xì)胞缺氧模型，觀察化學(xué)性缺氧狀態(tài)下食管鱗癌Eca-109細(xì)胞形態(tài)

10、學(xué)改變及其對HIF-1α表達(dá)的影響。
　　1.1倒置顯微鏡：觀察150μmol/L CoCl2培養(yǎng)液培養(yǎng)食管鱗癌細(xì)胞Eca-109模擬缺氧環(huán)境，并對Eca-109細(xì)胞在缺氧0h（常氧）、3h、6h、12h、24h、48h形態(tài)學(xué)改變，確定最佳缺氧作用培養(yǎng)時間（24h）。
　　1.2 Real-time PCR：檢測食管鱗癌Eca-109細(xì)胞在不同的缺氧時間0h（常氧）、3h、6h、12h、24h HIF-1αmRNA的表達(dá)情況

11、。
　　1.3 Western bloting：檢測食管鱗癌Eca-109細(xì)胞在不同的缺氧時間0h（常氧）、3h、6h、12h、24h HIF-1α蛋白的表達(dá)情況。
　　2.HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染管鱗癌Eca-109細(xì)胞，觀察不同HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染濃度下轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變及HIF-1αmRNA表達(dá)狀況，確定最佳HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染濃度及序列。
　　2.1倒置熒光顯微鏡：觀察不同HIF-1αsiR

12、NA轉(zhuǎn)染濃度（20nM、50nM、80nM、100nM）下轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變確定最佳轉(zhuǎn)染濃度（100nM）。
　　2.2 Real-time PCR：檢測使用不同HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染序列，轉(zhuǎn)染食管鱗癌Eca-109細(xì)胞24h后HIF-1αmRNA表達(dá)情況，確定HIF-1αsiRNA最佳轉(zhuǎn)染序列（HIF-1α-homo-1217）。
　　結(jié)果：
　　1.化學(xué)性細(xì)胞缺氧模型的建立及HIF-1α在不同缺氧時間的表

13、達(dá)
　　1.1倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，食管癌Eca-109細(xì)胞在六孔板底部呈多形、鋪路石樣鑲嵌分布，單層、貼壁生長，相互不重疊。在含150μmol/L CoCl2培養(yǎng)液中培養(yǎng)，隨著缺氧作用時間的延長，食管鱗癌Eca-109細(xì)胞逐步開始梭形化，部分細(xì)胞邊緣變的不規(guī)則，細(xì)胞內(nèi)部褐色顆粒增多，折光性下降，細(xì)胞碎片和懸浮死亡的細(xì)胞逐漸增多。缺氧0h（常氧）、3h、6h細(xì)胞死亡不明顯，缺氧12h時有少量梭形細(xì)胞和懸浮死亡細(xì)胞出現(xiàn)，缺氧24h時

14、梭形細(xì)胞和懸浮死亡細(xì)胞較缺氧12h顯著增多，細(xì)胞生長狀態(tài)較好；而缺氧48h時超過50％細(xì)胞死亡。為避免CoCl2對誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧損傷而引起的細(xì)胞凋亡對實驗結(jié)果的影響，在后續(xù)的實驗中，本次研究將選擇CoCl2作用24h作為缺氧組采樣觀察時間點。
　　1.2 Real-time PCR結(jié)果顯示：HIF-1αmRNA在食管鱗癌Eca-109細(xì)胞中缺氧0h（常氧）相對表達(dá)量為1±0.048。在缺氧3h、6h時相對表達(dá)量為0.732±0.10

15、2和0.613±0.114，較缺氧0h即常氧（1±0.048）有顯著的下降（P<0.05）；而缺氧12h、24h相對表達(dá)量分別為2.216±0.215、3.512±0.712，較缺氧0h（常氧）有顯著的增高（P<0.05）。
　　1.3 Western bloting結(jié)果顯示：HIF-1α蛋白在食管鱗癌Eca-109細(xì)胞中缺氧3h、6h、12h、24h時其表達(dá)量分別為：1.692±0.166、1.802±0.131、1.804±0

16、.094、2.099±0.095，較缺氧0h即常氧（0.631±0.086）有顯著的增高（P<0.05）。
　　2.使用HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染食管鱗癌Eca-109細(xì)胞阻斷HIF-1α基因的表達(dá)
　　2.1倒置熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，使用20nM Lipofectamine?2000和20nM帶熒光標(biāo)記HIF-1αsiRNA序列進(jìn)行轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)視野中少量綠色熒光標(biāo)記物質(zhì)，被轉(zhuǎn)染成功的綠色細(xì)胞數(shù)量非常低，腫瘤細(xì)胞生長良好，懸浮

17、死亡細(xì)胞不明顯；隨著各實驗組轉(zhuǎn)染試劑濃度的增加，視野中綠色熒光標(biāo)記物質(zhì)增多，被轉(zhuǎn)染成功的綠色細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，其中以100nM Lipofectamine?2000和100nM HIF-1αsiRNA共轉(zhuǎn)染組中被轉(zhuǎn)染成功的綠色細(xì)胞數(shù)量最多，轉(zhuǎn)染效率最高，且各實驗組腫瘤細(xì)胞生長狀態(tài)均良好，懸浮死亡細(xì)胞不明顯。故選擇使用100nM Lipofectamine?2000和100nM HIF-1αsiRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
　　2.2 Real

18、-time PCR結(jié)果顯示：HIF-1αmRNA在空白對照組、HIF-1α-homo-NC組、HIF-1α-homo-934組、HIF-1α-homo-1067組和HIF-1α-homo-1217組相對表達(dá)量分別為：1±0.091、0.912±0.214、0.802±0.122、0.571±0.074、0.182±0.020。與空白對照相比HIF-1α-homo-NC組中HIF-1αmRNA的表達(dá)量無明顯差別（P>0.05）；而其余實驗

19、組均顯著減少（P<0.05），其中，HIF-1α-homo-1217組HIF-1αmRNA的表達(dá)量最低。故選擇HIF-1α-homo-1217組siRNA轉(zhuǎn)染序列轉(zhuǎn)染進(jìn)行HIF-1α基因阻斷。
　　第二部分缺氧對食管鱗癌細(xì)胞IL-6、TGF-β1產(chǎn)生的影響
　　研究方法：
　　1.缺氧時間對食管鱗癌Eca-109細(xì)胞IL-6、TGF-β1產(chǎn)生的影響
　　1.1 Real-time PCR：檢測IL-6、TGF-β

20、1在不同缺氧時間0h(常氧)、3h、6h、12h、24h細(xì)胞內(nèi)mRNA表達(dá)情況。
　　1.2酶聯(lián)免疫吸附法（Elisa）：檢測食管鱗癌Eca-109細(xì)胞在不同缺氧時間0h（常氧）、3h、6h、12h、24h上清液中IL-6、TGF-β1的濃度。
　　2. HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染抑制 HIF-1α活性對IL-6、TGF-β1產(chǎn)生的影響
　　2.1 Real-time PCR：檢測食管鱗癌Eca-109細(xì)胞常氧組（只加

21、培養(yǎng)液）、缺氧組（含150μmol/L CoCl2培養(yǎng)液）、HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染組（HIF-1αsiRNA）、雙重作用組（150μmol/L CoCl2+HIF-1αsiRNA）培養(yǎng)24h后，IL-6、TGF-β1的mRNA表達(dá)情況。
　　2.2酶聯(lián)免疫吸附法（Elisa）：檢測食管鱗癌Eca-109細(xì)胞常氧組、缺氧組、HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染組、雙重作用組培養(yǎng)24h后培養(yǎng)基上清液中IL-6、TGF-β1的濃度。
　

22、　結(jié)果：
　　1.缺氧時間對食管鱗癌Eca-109細(xì)胞IL-6、TGF-β1產(chǎn)生的影響
　　1.1 Real-time PCR結(jié)果顯示：IL-6 mRNA缺氧3h、6h、12h、24h相對表達(dá)量分別為1.154±0.169、1.249±0.215、1.970±0.359、2.874±0.448，較缺氧0h（常氧）相對表達(dá)量（1±0.216）有顯著的增高（P<0.05）。TGF-β1 mRNA在缺氧3h、6h、12h、24h相

23、對表達(dá)量分別為1.286±0.210、1.637±0.147、1.913±0.578、2.557±0.194，較缺氧0h（常氧）相對表達(dá)量（1±0.024）有顯著的增高（P<0.05）。
　　1.2酶聯(lián)免疫吸附法（Elisa）結(jié)果顯示：IL-6在培養(yǎng)基上清液中活性蛋白分泌量在缺氧3h、6h為19.115±2.005、23.313±1.820（pg/ml），較缺氧0h（常氧）分泌量（30.201±2.197pg/ml）顯著下降（P<

24、0.05）;而缺氧12h、24h時的分泌量為31.434±10.558、43.403±7.824（pg/ml），較缺氧0h（常氧）顯著增高（P<0.05）。TGF-β1的活性蛋白分泌量在缺氧0h（常氧）、缺氧3h、6h、12h分別為80.424±9.228、75.412±0.305、84.251±7.014、74.539±23.117（pg/ml）；而缺氧24h時分泌量為207.551±9.154 pg/ml，較缺氧0h（常氧）有顯著的

25、增高（P<0.05）。
　　2.轉(zhuǎn)染HIF-1αsiRNA抑制 HIF-1α活性可減少IL-6、TGF-β1的產(chǎn)生2.1 Real-time PCR結(jié)果顯示：IL-6 mRNA的相對表達(dá)量在HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染組（0.314±0.147）、雙重作用組（0.847±0.162）顯著低于常氧組（1±0.126）、缺氧組（1.601±0.296）中的表達(dá)（P<0.05）；且HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染組中IL-6 mRNA的相對表達(dá)

26、量顯著低于雙重作用組（P<0.05）。TGF-β1的相對表達(dá)量在HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染組（0.198±0.052）、雙重作用組（0.522±0.294）顯著低于常氧組（1±0.208）、缺氧組（3.122±0.317）中的表達(dá)（P<0.05）；且HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染組中TGF-β1 mRNA的相對表達(dá)量顯著低于雙重作用組（P<0.05）。
　　2.2酶聯(lián)免疫吸附法（Elisa）結(jié)果顯示：IL-6活性蛋白在食管鱗癌Eca-

27、109細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中的分泌量在HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染組（15.543±2.143 pg/ml）顯著低于常氧組（27.796±1.896 pg/ml）、缺氧組（43.002±3.518pg/ml）和雙重作用組（29.042±1.257 pg/ml）（P<0.05），且HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染組中IL-6蛋白分泌量顯著低于雙重作用組（P<0.05）。TGF-β1活性蛋白在食管鱗癌Eca-109細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中的分泌量在HIF-1

28、αsiRNA轉(zhuǎn)染組（86.737±15.457 pg/ml）顯著低于常氧組（171.757±24.773pg/ml）、缺氧組（230.293±2.677 pg/ml）、雙重作用組（153.667±35.704pg/ml）（P<0.05），且HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染組中TGF-β1蛋白分泌量顯著低于雙重作用組（P<0.05）。
　　第三部分缺氧在食管鱗癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用
　　研究方法：
　　1.轉(zhuǎn)染HIF-1α

29、siRNA后食管鱗癌Eca-109細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化
　　倒置顯微鏡：檢測食管鱗癌Eca-109細(xì)胞在常氧組（只加培養(yǎng)液）、缺氧組（含150μmol/L CoCl2培養(yǎng)液）、HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染組（HIF-1αsiRNA）、雙重作用組（150μmol/L CoCl2+HIF-1αsiRNA）培養(yǎng)24h后，細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　2.轉(zhuǎn)染HIF-1αsiRNA對各組細(xì)胞HIF-1α、E-cadherin、Vimentin表達(dá)的

30、影響
　　2.1 Real-time PCR：檢測食管鱗癌Eca-109細(xì)胞常氧組、缺氧組、HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染組、雙重作用組培養(yǎng)24h后，HIF-1α、E-cadherin、Vimentin的mRNA表達(dá)情況。
　　2.2 Western bloting：檢測食管鱗癌Eca-109細(xì)胞在常氧組、缺氧組、HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染組、雙重作用組培養(yǎng)24h后，HIF-1α、E-cadherin、Vimentin的細(xì)胞內(nèi)蛋

31、白表達(dá)情況。
　　3.轉(zhuǎn)染HIF-1αsiRNA對食管鱗癌Eca-109細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響
　　3.1 Transwell體外遷移實驗：檢測 HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染24h后食管鱗癌Eca-109細(xì)胞體外遷移運動能力的變化。
　　3.2 Transwell體外侵襲實驗：檢測 HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染24h后食管鱗癌Eca-109細(xì)胞體外侵襲能力的變化。
　　結(jié)果：
　　1.轉(zhuǎn)染HIF-1αsi

32、RNA后食管鱗癌Eca-109細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化
　　倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：食管癌Eca-109細(xì)胞在六孔板底部呈多形、鋪路石樣鑲嵌分布，單層、貼壁生長，相互不重疊。與缺氧組相比，常氧組、HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染組及雙重作用組中細(xì)胞間隙少，細(xì)胞排列較為緊密，梭形細(xì)胞和懸浮死亡細(xì)胞的數(shù)量相對較少；HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染組中長梭形細(xì)胞數(shù)量最少。
　　2.轉(zhuǎn)染HIF-1αsiRNA抑制HIF-1α活性，可部分抑制食管鱗癌Eca-

33、109細(xì)胞的EMT轉(zhuǎn)化
　　2.1 Real-time PCR結(jié)果顯示：HIF-1αmRNA的相對表達(dá)量在HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染組（0.148±0.087）、雙重作用組（0.252±0.091），顯著低于常氧組（1±0.011）、缺氧組（2.417±0.104）（P<0.05），并且HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染組HIF-1αmRNA的相對表達(dá)量顯著低于雙重作用組（P<0.05）。E-cadherin mRNA的相對表達(dá)量在HIF

34、-1αsiRNA轉(zhuǎn)染組（1.711±0.357）、雙重作用組（1.221±0.129），顯著高于常氧組（1±0.126）、缺氧組（0.201±0.226）（P<0.05），并且HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染組E-cadherin mRNA相對表達(dá)量顯著高于雙重作用組（P<0.05）。Vimentin mRNA相對表達(dá)量在HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染組（0.617±0.076），顯著低于常氧組（1±0.241）、缺氧組（2.283±0.348）

35、和雙重作用組（1.247±0.196）（P<0.05）。
　　2.2 Western bloting結(jié)果表明：HIF-1α蛋白的相對表達(dá)量在HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染組（0.343±0.019）、雙重作用組（0.420±0.021），顯著低于常氧組（1.121±0.094）、缺氧組（1.553±0.135）（P<0.05），并且HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白的相對表達(dá)量顯著低于雙重作用組（P<0.05）。E-c

36、adherin蛋白的相對表達(dá)量在 HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染組（3.971±0.097）、雙重作用組（3.673±0.017），顯著高于常氧組（3.270±0.020）、缺氧組（1.978±0.035）（P<0.05），并且HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染組E-cadherin蛋白的相對表達(dá)量顯著高于雙重作用組（P<0.05）。Vimentin蛋白相對表達(dá)量在在HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染組（1.849±0.155）、雙重作用組（2.163±

37、0.183），顯著低于常氧組（2.506±0.132）、缺氧組（4.376±0.097）（P<0.05），并且HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染組Vimentin蛋白的相對表達(dá)量顯著低于雙重作用組（P<0.05）。
　　3.轉(zhuǎn)染HIF-1αsiRNA抑制HIF-1α基因的表達(dá)能夠降低腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力
　　3.1 Transwell體外遷移實驗結(jié)果顯示：細(xì)胞穿膜數(shù)缺氧組（475.33±21.54）最多，常氧組細(xì)胞的穿膜數(shù)（31

38、2.18±12.32）次之，HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染組（157.28±15.68）和雙重作用組（202.37±15.26）的細(xì)胞穿膜數(shù)顯著降低（P<0.05），HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞穿膜數(shù)最少，說明轉(zhuǎn)染HIF-1αsiRNA之后，在一定程度上抑制了食管癌Eca-109細(xì)胞的體外遷移能力。
　　3.2 Transwell體外侵襲實驗結(jié)果顯示：細(xì)胞穿膜數(shù)缺氧組（143.28±11.52）最多，常氧組細(xì)胞的穿膜數(shù)（85.4

39、3±8.03）次之，HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染組（36.16±10.34）與雙重作用組（69.34±10.50）顯著減少（P<0.05），且HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞穿膜數(shù)最少。說明轉(zhuǎn)染HIF-1αsiRNA之后，食管癌Eca-109細(xì)胞的體外侵襲能力受到了抑制。
　　結(jié)論：
　　1.缺氧可誘導(dǎo)食管鱗癌Eca-109細(xì)胞中IL-6、TGF-β1的mRNA表達(dá)和蛋白分泌增加。
　　2.缺氧可誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞發(fā)生EM