靈芝多糖對(duì)LA795肺癌細(xì)胞分泌VEGF、TGF-β1、IL-10的影響.pdf

1、目的:
　　肺癌是一種高度惡性的腫瘤,其發(fā)病率高,預(yù)后差,嚴(yán)重威脅人類健康和生命。近年來,許多國(guó)家都報(bào)道肺癌的發(fā)病率和死亡率均顯著提高。肺癌的治療包括手術(shù)治療,放射治療,化學(xué)治療和免疫治療,其中手術(shù)治療是公認(rèn)的早期肺癌治療的首選方法,在失去手術(shù)機(jī)會(huì)的肺癌病人中化療是其主要治療方法(超過90％的肺癌需要化療治療),近來免疫治療也進(jìn)展迅速并進(jìn)入臨床應(yīng)用。
　　有研究表明,在肺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)

2、因子-β1(TGF-β1)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)等免疫抑制分子水平增高。腫瘤細(xì)胞分泌免疫抑制分子抑制機(jī)體免疫功能,是腫瘤細(xì)胞免疫逃逸并使得腫瘤得以發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制。我們是否可通過某些物質(zhì)拮抗腫瘤細(xì)胞分泌免疫抑制分子,從而達(dá)到治療腫瘤的目的值得研究。
　　靈芝是我國(guó)傳統(tǒng)中藥,有2000多年的用藥歷史。現(xiàn)代研究表明靈芝多糖(ganoderma lucidum polysaeeharides,Gl-PS)是靈芝的主要

3、活性成分之一,可作用于免疫系統(tǒng),提高免疫功能,從而發(fā)揮抗腫瘤作用;亦有少數(shù)實(shí)驗(yàn)顯示靈芝多糖可直接抑制腫瘤細(xì)胞;而通過拮抗腫瘤產(chǎn)生免疫抑制物得以發(fā)揮抗腫瘤的作用機(jī)制尚未完全闡明。有實(shí)驗(yàn)表明,靈芝多糖可拮抗B16F10黑色素瘤細(xì)胞分泌免疫抑制分子,但靈芝多糖是否具有拮抗其他腫瘤細(xì)胞分泌免疫抑制分子的作用尚需進(jìn)一步確定。本實(shí)驗(yàn)選用LA795肺癌細(xì)胞,探討靈芝多糖對(duì)這種腫瘤細(xì)胞分泌免疫抑制分子的影響,拓展對(duì)靈芝多糖抗腫瘤機(jī)制的認(rèn)識(shí),為肺癌的免疫

4、治療提供新思路。
　　方法:
　　1.細(xì)胞來源:本實(shí)驗(yàn)采用的LA795細(xì)胞是一種來源于小鼠的肺腺癌細(xì)胞系。
　　2.實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù):實(shí)驗(yàn)依據(jù)培養(yǎng)LA795肺癌細(xì)胞的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中所含靈芝多糖濃度不同進(jìn)行分組,設(shè)0.2μg/ml、0.8μg/ml、3.2μg/ml、12.8μg/ml五個(gè)實(shí)驗(yàn)組,以完全培養(yǎng)基為空白對(duì)照。
　　3.采用免疫 ELISA方法,檢測(cè)各組細(xì)胞 VEGF、TGF-β1、IL-1

5、0因子的表達(dá)情況。
　　4.采用RT-qPCR技術(shù),檢測(cè)各組細(xì)胞VEGF、TGF-β1、IL-10在基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)差異。
　　5.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:應(yīng)用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,對(duì)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析,p<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.從表達(dá)量和基因水平檢測(cè)靈芝多糖對(duì)LA795肺腺癌細(xì)胞分泌VEGF的影響:在不同濃度靈芝多糖(0μg/ml、0.2μg/ml、0.8μg/ml、3.2μg

6、/ml、12.8μg/ml)作用下,各組LA795肺癌細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)48h,應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測(cè)顯示,LA795肺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中 VEGF表達(dá)水平分別為147.98±0.28、120.25±14.24、103.11±10.57、91.27±13.62、84.66±10.41,以空白對(duì)照組的VEGF的表達(dá)水平最高,隨靈芝多糖濃度的不斷增高,LA795肺癌細(xì)胞VEGF表達(dá)水平逐漸降低。經(jīng)單因素方差分析,差異有顯著性(F=15.912,P<

7、0.005)。0μg/ml組與0.2μg/ml組、0.8μg/ml組、3.2μg/ml組、12.8μg/ml組之間比較,差異均有顯著性(P<0.05)。應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)顯示,LA795肺癌細(xì)胞 VEGF mRNA的表達(dá)水平分別為1.00±0.00、0.67±0.24、0.68±0.24、0.48±0.21、0.50±0.23,以空白對(duì)照組的VEGF mRNA的表達(dá)水平最高,應(yīng)用靈芝多糖濃度后,LA795肺癌細(xì)胞 VEGF mR

8、NA表達(dá)水平降低。經(jīng)單因素方差分析,差異有顯著性(F=3.034,P<0.1)。0μg/ml組與3.2μg/ml組、12.8μg/ml組之間比較,差異有顯著性(P<0.05)。結(jié)果顯示靈芝多糖可抑制LA795肺癌細(xì)胞VEGF基因轉(zhuǎn)錄。
　　2.從表達(dá)量和基因水平檢測(cè)靈芝多糖對(duì) LA795肺癌細(xì)胞分泌 TGF-β1的影響:在不同濃度靈芝多糖(0μg/ml、0.2μg/ml、0.8μg/ml、3.2μg/ml、12.8μg/ml)作用

9、下,各組LA795肺癌細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)48h,應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測(cè)顯示,LA795肺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中 TGF-β1表達(dá)水平分別為98.78±12.02、87.01±5.97、71.98±8.54、58.96±13.24、54.08±14.84,以空白對(duì)照組的TGF-β1的表達(dá)水平最高,隨靈芝多糖濃度的不斷增高,LA795肺癌細(xì)胞TGF-β1表達(dá)水平逐漸降低。經(jīng)單因素方差分析,差異有顯著性(F=8.152,P<0.005)。0μg/ml組與

10、3.2μg/ml組、12.8μg/ml組之間比較,差異有顯著性(P<0.05)。應(yīng)用 RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)顯示,LA795肺癌細(xì)胞 TGF-β1 mRNA的表達(dá)水平分別為1.00±0.00、1.24±0.25、0.84±0.22、0.56±0.15、0.46±0.06以空白對(duì)照組和0.2μg/ml組的TGF-β1 mRNA的表達(dá)水平最高(二組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P>0.005),隨靈芝多糖濃度的不斷增高,LA795肺癌細(xì)胞TGF-β

11、1 mRNA表達(dá)水平逐漸降低。經(jīng)單因素方差分析,差異有顯著性(F=11.145,P<0.005)。0μg/ml組與3.2μg/ml組、12.8μg/ml組之間比較,差異有顯著性(P<0.05)。結(jié)果顯示靈芝多糖可抑制LA795肺癌細(xì)胞TGF-β1基因轉(zhuǎn)錄。
　　3.從表達(dá)量和基因水平檢測(cè)靈芝多糖對(duì) LA795肺癌細(xì)胞分泌 IL-10的影響:在不同濃度靈芝多糖(0μg/ml、0.2μg/ml、0.8μg/ml、3.2μg/ml、12

12、.8μg/ml)作用下,各組LA795肺癌細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)48h,應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測(cè)顯示,LA795肺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中 IL-10表達(dá)水平分別為57.04±3.45、46.53±4.23、41.54±1.59、41.54±4.21、36.49±0.80,以空白對(duì)照組的IL-10的表達(dá)水平最高,應(yīng)用靈芝多糖濃度后,LA795肺癌細(xì)胞IL-10表達(dá)水平降低。經(jīng)單因素方差分析,差異有顯著性(F=17.975,P<0.001)。0μg/ml組與

13、0.2μg/ml組、0.8μg/ml組、3.2μg/ml組、12.8μg/ml組之間比較,差異均有顯著性(p<0.05)。應(yīng)用 RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)顯示,LA795肺癌細(xì)胞IL-10 mRNA的表達(dá)水平分別為1.00±0.00、0.98±0.09、0.64±0.17、0.36±0.10、0.39±0.10,空白對(duì)照組的IL-10 mRNA的表達(dá)水平最高,應(yīng)用靈芝多糖后,LA795肺癌細(xì)胞IL-10 mRNA表達(dá)水平降低。經(jīng)單因素方差分

14、析,差異有顯著性(F=24.319,P<0.001)。0μg/ml組與0.8μg/ml組、3.2μg/ml組、12.8μg/ml組之間比較,差異均有顯著性(P<0.05)。結(jié)果顯示靈芝多糖可抑制LA795肺癌細(xì)胞IL-10基因轉(zhuǎn)錄。
　　結(jié)論:
　　1.LA795肺癌細(xì)胞可分泌免疫抑制分子VEGF、TGF-β1、IL-10。
　　2.靈芝多糖可下調(diào) LA795肺癌細(xì)胞分泌免疫抑制分子VEGF、TGF-β1、IL-10。