輸注過表達TGF-β1和Il-10的供體樹突狀細胞對小鼠胰島移植的影響.pdf

1、目的:
　　胰島移植方法已逐漸成熟，可以替代采用外源性的胰島素輸注治療Ⅰ型糖尿病，然則移植后排斥反應(yīng)不可避免，誘導(dǎo)抗原特異性的移植耐受變成解決排斥反應(yīng)難題的關(guān)鍵。構(gòu)建攜帶人IL-10、TGF-β1有效基因片段的慢病毒載體，對兩者單獨及聯(lián)合感染樹突狀細胞后誘導(dǎo)胰島移植免疫耐受的情況進行比較，探討移植免疫耐受機制及尋找延長小鼠胰島移植物存活時間的最佳途徑。
　　方法:
　　1.構(gòu)建攜帶人TGF-β1和IL-10基因片段的慢

2、病毒，兩種病毒單獨及聯(lián)合感染DC2.4細胞，并篩選感染后穩(wěn)定表達株。
　　2.依次將細胞分成A、B、C、D四個組:DC2.4作為對照(A)，IL-10過表達的慢病毒感染后DC2.4(B)，TGF-β1過表達的慢病毒感染后DC2.4(C)，及兩者聯(lián)合感染后DC2.4(D)。運用流式細胞儀檢測每組DC細胞CD80、CD86、MHCII的表達差異。分別提取四組DC細胞的RNA及蛋白，RT-PCR檢測IL-12、IL-4、IL-6、IFN

3、-Y等因子的表達;Westernblot檢測TGF-β1、IL-10、IDO的表達量。
　　3.將四組DC細胞分別通過尾靜脈注射到16只受體小鼠(BALB/c)體內(nèi)，32只C57BL/6(H-2b)作為供體，進行腎被膜下胰島移植。移植后21天取受體小鼠脾臟T淋巴細胞，流式細胞儀檢測其CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞所占比例;移植后100天取受體小鼠腎臟，免疫組化法觀察移植物存活時間。
　　4.運用SPSS17.0統(tǒng)

4、計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，感染組兩兩間的比較采用LSD檢驗。
　　結(jié)果:
　　1.構(gòu)建過表達TGF-β1和IL-10的慢病毒載體成功感染了DC2.4細胞。
　　2.慢病毒單獨及聯(lián)合感染DC后，細胞表面分子CD80、CD86、MHCII的表達量下調(diào)。感染后的三組細胞，IL-4 mRNA表達上調(diào)的同時下調(diào)IL-12、IL-6、IFN-mRNA表達。Western Blot結(jié)果顯示，慢病毒感染的DC細胞組TGF-β1、IL-

5、10、IDO的蛋白表達均上調(diào)，聯(lián)合感染組與單獨感染組間沒有顯著差異。流式細胞儀檢測的結(jié)果表明，接受供體過表達TGF-β1和IL-10基因的樹突狀細胞后，受體小鼠脾臟T淋巴細胞的CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例升高，三個感染組間無明顯差異，這與前面的RT-PCR及WB結(jié)果相一致。
　　3.免疫組化切片染色顯示，胰島移植后100天，接受供體過表達TGF-β1和IL-10的DC后，受體小鼠腎被膜下可見胰島移植物仍然存活。