慢病毒載體介導(dǎo)的Il-10誘導(dǎo)小鼠骨髓來源耐受性樹突狀細(xì)胞的形成.pdf

1、目的：探索體外培養(yǎng)小鼠骨髓來源未成熟樹突狀細(xì)胞(immature dendriticcells，imDCs)的實(shí)驗(yàn)條件和方法。探討重組IL-10慢病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠imDCs，構(gòu)建高分泌IL-10的耐受性樹突狀細(xì)胞(tolerogenic dendritic cells，Tol-DCs)的可行性。
　　 方法：無菌條件下體外分離獲得小鼠骨髓來源單核細(xì)胞，通過低劑量重組小鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重組白細(xì)胞介

2、素4(rmlL-4)聯(lián)合誘導(dǎo)并經(jīng)CD11c免疫磁珠分選的方法獲得小鼠imDCs，取部分細(xì)胞加入腫瘤壞死因子-α(TNF-α)刺激誘導(dǎo)為成熟樹突狀細(xì)胞(mature dendritic cells，mDCs)。倒置顯微鏡下觀察DC形態(tài)變化，流式細(xì)胞術(shù)分析比較imDCs和mDCs的表型差異。IL-10重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠imDCs，同時(shí)設(shè)計(jì)GFP慢病毒轉(zhuǎn)染DC陽性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染DC陰性對(duì)照組，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)，

3、通過ELISA法檢測(cè)各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞的IL-10表達(dá)情況。將IL-10重組慢病毒轉(zhuǎn)染imDCs和未轉(zhuǎn)染imDCs分別行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，觀察T淋巴細(xì)胞增殖情況，然后分別取反應(yīng)細(xì)胞與刺激細(xì)胞比例為1:10的細(xì)胞混合液，同時(shí)設(shè)計(jì)未加imDCs的單一T細(xì)胞陰性對(duì)照組，行流式細(xì)胞術(shù)分析三組調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例的變化。
　　 結(jié)果：利用低劑量rmGM-CSF和rmlL-4聯(lián)合誘導(dǎo)小鼠骨髓來源前體細(xì)胞并經(jīng)CD11c免疫磁珠分選的方法，獲得了大量高純

4、度的imDCs，細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間的延長表現(xiàn)出典型的樹突狀形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示imDCs與mDCs比較，細(xì)胞表面MHCⅡ、CD80、CD86因子表達(dá)水平均顯著低于后者。IL-10慢病毒轉(zhuǎn)染imDCs后，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞GFP高度表達(dá)，ELISA結(jié)果顯示IL-10轉(zhuǎn)染DC組的IL-10表達(dá)水平明顯高于GFP轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組(P<0.001)，GFP轉(zhuǎn)染組與空白對(duì)照組均低水平分泌IL-10，之間無明顯差異(P=0.997，>0.

5、05)?；旌狭馨图?xì)胞反應(yīng)及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果分別提示imDCs經(jīng)IL-10重組慢病毒轉(zhuǎn)染后其刺激T細(xì)胞增殖能力減弱(P<0.01)，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例得到提高(P<0.01)。
　　 結(jié)論：采用低劑量GM-CSF和IL-4細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)小鼠骨髓單核細(xì)胞的方法，獲得了低表達(dá)共刺激因子的未成熟樹突狀細(xì)胞。將IL-10重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠未成熟樹突狀細(xì)胞，所轉(zhuǎn)導(dǎo)的IL-10基因在未成熟樹突狀細(xì)胞內(nèi)高效、穩(wěn)定地表達(dá)?；蛐揎椇蟮奈闯墒鞓?/p>