耐受性樹突狀細(xì)胞對免疫介導(dǎo)性再生障礙性貧血小鼠骨髓造血功能的影響.pdf

1、目的：篩選耐受性樹突狀細(xì)胞(tolerogenic dendritic cells，tDCs)的體外培養(yǎng)方法，探索其對免疫介導(dǎo)性再生障礙性貧血模型小鼠造血功能的影響，為tDCs治療再生障礙性貧血的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方法：采用雌性Balb/c小鼠為供體，雌性昆明小鼠為受體。取供體小鼠骨髓細(xì)胞，分離單個(gè)核細(xì)胞。在含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中加入不同因子組合分為五組進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)：空白組(不加任何因子)、常規(guī)D

2、Cs組(GM—CSF100ng/ml+IL-4100ng/ml)、VD1-DCs 組(GM-CSF20ng/ml+VIP40ng/ml+DXM10ng/ml)、VD2-DCs組(GM-CSF20ng/ml+VIP40ng/ml+DXM50ng/ml)、VD3-DCs組(GM-CSF20ng/ml+VIP40ng/ml+DXM100ng/ml)。光鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞CD80、CD86、CD40、CD11c表達(dá)，MTT

3、法檢測DCs刺激淋巴細(xì)胞增殖活性。40只受體小鼠分為正常對照組、模型組、tDCs組、單純照射組。模型組：昆明小鼠經(jīng)X射線亞致死量(7Gy)全身均勻照射后，于4小時(shí)內(nèi)自尾靜脈輸入Balb/c小鼠的胸腺淋巴結(jié)細(xì)胞1X106只。tDCs組：制模后第3天、第5天分別輸注tDCs1×106/只。動(dòng)態(tài)觀察小鼠外周血白細(xì)胞變化，小鼠瀕死時(shí)(或制模后第28天)，取股骨行骨髓病理切片觀察，計(jì)數(shù)單側(cè)骨髓有核細(xì)胞數(shù)，甲基纖維素半固體培養(yǎng)法測定CFU-GM集落

4、數(shù)，流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞CD8+T細(xì)胞、CD4+CD25+T細(xì)胞的表達(dá)。 結(jié)果： 1、利用GM-CSF、IL-4、VIP、DXM、LPS等因子體外培養(yǎng)能誘導(dǎo)生成具有典型樹枝狀突起的DCs。常規(guī)DCs組、VD1-DCs組、VD2-DCs組、VD3-DCs組CD11c的表達(dá)較高，與空白組比較有顯著性差異(P＜0.05)。 2、VD1-DCs組、VD2-DCs組、VD3-DCs組CD40、CD80、CD86表達(dá)

5、和淋巴細(xì)胞增殖活性均低于常規(guī)DCs組(P＜0.05)，其中VD1-DCs組(VIP濃度為40ng/ml、DXM為10ng/ml)最低，差異最明顯。 3、再生障礙性貧血模型組小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)持續(xù)下降，制模后第28天生存率10％，單側(cè)股骨骨髓有核細(xì)胞數(shù)及CFU-GM集落數(shù)明顯減少，與tDCs組、單純照射組相比有明顯差異(P＜0.05)。骨髓病理切片顯示：骨髓增生極度低下，造血細(xì)胞極度減少，大量脂肪細(xì)胞填充骨髓腔。脾淋巴細(xì)胞CD8+

6、T細(xì)胞的表達(dá)明顯升高，CD4+CD25+T細(xì)胞的表達(dá)明顯降低，與tDCs組、正常對照組相比有明顯差異(P＜0.05)。 4、tDCs組小鼠在制模后白細(xì)胞數(shù)有所下降，第10天下降至低點(diǎn)(1.52×109/L)，此后逐漸恢復(fù)至正常。制模后第28天生存率70％。tDCs組單側(cè)股骨骨髓有核細(xì)胞數(shù)及CFU-GM集落數(shù)與正常對照組、單純照射組無明顯差異(P＞0.05)，與模型組比較差異明顯(P＜0.05)。骨髓病理切片示骨髓增生活躍，脂肪細(xì)

7、胞較少，與正常對照組相似。tDCs組小鼠脾淋巴細(xì)胞CD4+CD25+T細(xì)胞的表達(dá)明顯升高，與模型組比較有明顯差異(P＜0.05)。 結(jié)論： 1.小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，體外經(jīng)GM-CSF、VIP、DXM、LPS聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)生成耐受性樹突狀細(xì)胞(tDCs)，其中VIP40ng/ml聯(lián)合DXM10ng/ml的培養(yǎng)條件最佳。 2.小鼠經(jīng)X射線7Gy全身均勻照射后，于4小時(shí)內(nèi)自尾靜脈輸入供體小鼠的胸腺淋巴結(jié)細(xì)胞1×106/只