重型再生障礙性貧血骨髓造血免疫損傷機(jī)制及其相關(guān)抗原的研究.pdf

1、目的：
　　通過研究重型再生障礙性貧血(Severe Aplastic Anemia，SAA)患者CD8+HLA-DR+效應(yīng)T細(xì)胞功能因子表達(dá)水平、對(duì)骨髓造血細(xì)胞的損傷及其作用的靶細(xì)胞，證實(shí)CD8+HLA-DR+效應(yīng)T細(xì)胞與SAA患者骨髓衰竭之間的“因果效應(yīng)”及“因果方式”，進(jìn)一步闡明SAA免疫損傷骨髓造血的機(jī)制；同時(shí)采用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對(duì)SAA患者與正常人髓樣樹突狀細(xì)胞(myeloid dendritic cells，mDC

2、)的蛋白質(zhì)成份進(jìn)行分析，篩選激活SAA免疫反應(yīng)可能的抗原物質(zhì)，即導(dǎo)致SAA發(fā)病可能的自身抗原，為開發(fā)靶向治療藥物提供依據(jù)。
　　方法：
　　研究對(duì)象為天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院自2010年4月至2012年4月初治SAA患者、治療后緩解的SAA患者及正常對(duì)照者。第一部分研究效應(yīng)T細(xì)胞損傷骨髓造血細(xì)胞的途徑，采用免疫磁珠分選24例SAA初治患者及23名健康正常人外周血CD8+HLA-DR+效應(yīng)T細(xì)胞，半定量RT-PCR檢測分選細(xì)胞效應(yīng)因

3、子穿孔素、顆粒酶B、腫瘤壞死因子-β(tumor necrosis factor beta，TNF-β)、FasL mRNA表達(dá)情況。第二部分驗(yàn)證SAA患者效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)骨髓造血細(xì)胞的損傷作用，以免疫磁珠陽性分選12例SAA初治患者、12例SAA緩解患者及12名正常健康人CD8+HLA-DR+T細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，陰性分選去除SAA緩解患者、正常健康人骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CD3+T細(xì)胞后作為靶細(xì)胞，將SAA初治患者效應(yīng)細(xì)胞分別與SAA緩解患者及

4、正常健康人靶細(xì)胞混合培養(yǎng)(分別為實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2)，同時(shí)設(shè)SAA緩解患者效應(yīng)T細(xì)胞與SAA緩解患者骨髓靶細(xì)胞混合培養(yǎng)組及正常健康人效應(yīng)T細(xì)胞與正常健康人靶細(xì)胞混合培養(yǎng)組作為對(duì)照(分別為對(duì)照組1、對(duì)照組2)，72h后通過流式細(xì)胞術(shù)以膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)檢測靶細(xì)胞凋亡狀況，全自動(dòng)生化分析儀檢測培養(yǎng)體系上清液乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase，LDH)水平。第三部分明確SAA患者靶向損傷的骨髓造血細(xì)胞，分別將S

5、AA患者、正常人CD8+HLA-DR+效應(yīng)T細(xì)胞與正常人的CD3-細(xì)胞(免疫磁珠分選獲得)混合培養(yǎng)，72h后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測培養(yǎng)系中CD14+、CD33+、CD34+、GlycoA+細(xì)胞凋亡狀況；以單克隆抗體標(biāo)記SAA患者和正常人骨髓CD34+、GlycoA+、CD33+、CD14+細(xì)胞，比較其Fas蛋白的表達(dá)量。第四部分探索導(dǎo)致SAA免疫激活的抗原物質(zhì)，采用貼壁培養(yǎng)法將SAA患者、緩解患者及正常人單核細(xì)胞，體外誘導(dǎo)、分化為成熟的mD

6、C，流式細(xì)胞儀分選得到高純度mDC，提取總蛋白，進(jìn)行雙向電泳分離蛋白質(zhì)，取差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)，明確SAA患者mDC內(nèi)與正常人不同的蛋白質(zhì)成分，即為激活mDC，引起SAA一系列自身免疫反應(yīng)可能的抗原物質(zhì)。
　　結(jié)果：
　　第一部分 SAA初治組CD8+HLA-DR+效應(yīng)T細(xì)胞穿孔素、顆粒酶B mRNA的表達(dá)量分別為(0.66±0.25)、(0.56±0.26)，正常對(duì)照組表達(dá)量為(0.53±0.14)、(0.40±0.13)

7、，前者明顯高于后者(P值分別為0.042、0.012)；SAA初治組CD8+HLA-DR+效應(yīng)T細(xì)胞FasL mRNA的表達(dá)量為(0.77±0.24)，明顯高于正常對(duì)照組(0.61±0.16)(P=0.011)；SAA初治組CD8+HLA-DR+效應(yīng)T細(xì)胞TNF-β mRNA的表達(dá)量為(0.58±0.16)，亦明顯高于正常對(duì)照組(0.46±0.15)(P=0.011)。
　　第二部分 SAA初治患者效應(yīng)細(xì)胞與SAA緩解患者靶細(xì)胞混

8、合培養(yǎng)組(實(shí)驗(yàn)組1)、SAA初治患者效應(yīng)細(xì)胞與正常健康人靶細(xì)胞混合培養(yǎng)組(實(shí)驗(yàn)組2)靶細(xì)胞凋亡比例分別為(41.12±24.84)％、(45.81±20.47)％，SAA緩解患者效應(yīng)細(xì)胞與SAA緩解靶細(xì)胞混合培養(yǎng)組(緩解組)、正常人效應(yīng)細(xì)胞與正常人靶細(xì)胞混合培養(yǎng)組(正常組)靶細(xì)胞凋亡比例分別為(35.03±22.09)％、(20.95±13.82)％，實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2、緩解組三組間兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)

9、驗(yàn)組2、緩解組均明顯高于正常組(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2培養(yǎng)體系上清液LDH水平分別為(74.56±49.13)U/L、(62.61±31.76)U/L，明顯高于正常組的LDH水平(28.60±8.91)U/L(P<0.05)，與緩解組LDH水平(61.06±28.41)U/L比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，緩解組LDH水平明顯高于正常組(P<0.05)。
　　第三部分 SAA組骨髓CD34+細(xì)胞Fas蛋白的表達(dá)量

10、為46.59±27.60％，明顯高于對(duì)照組(8.89±7.28％，P<0.01)；SAA組CD14+、CD33+、GlycoA+細(xì)胞Fas蛋白的表達(dá)量分別為29.29±9.23％、46.88±14.30％、15.15±9.26％，明顯低于對(duì)照組(51.25±38.36％、72.06±39.88％、50.38±39.88％，P<0.05)。SAA初治患者效應(yīng)細(xì)胞與正常健康人靶細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)CD34+、CD33+、CD14+細(xì)胞凋亡率分別為

11、55.43±20.50％、38.13±20.10％、61.87±21.65％，均明顯高于正常人效應(yīng)細(xì)胞與正常人靶細(xì)胞混合培養(yǎng)組(對(duì)照組)35.02±13.95％、23.44±10.33％、37.04±22.41％(P均<0.05)；實(shí)驗(yàn)組CD45-細(xì)胞凋亡率為26.43±24.99％，與對(duì)照組22.76±7.62％無明顯差異(P>0.05)。
　　第四部分 SAA患者mDC細(xì)胞內(nèi)蛋白成分與緩解后患者及正常人之間進(jìn)行對(duì)比，其凋亡相關(guān)

12、蛋白(p53、caspase3、Fas)，核糖體連接蛋白、泛素化相關(guān)蛋白表達(dá)增高，與SAA免疫發(fā)病機(jī)制中mDC細(xì)胞激活相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　(1)SAA患者外周血CD8+HLA-DR+效應(yīng)T細(xì)胞穿孔素、顆粒酶表達(dá)水平均較正常人明顯升高，提示穿孔素、顆粒酶可能在SAA患者細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)損傷骨髓造血過程起到了重要的作用；SAA患者CD8+HLA-DR+T效應(yīng)細(xì)胞FasL表

13、達(dá)亦明顯增高，可能參與了骨髓造血靶細(xì)胞的凋亡損傷，同時(shí)高表達(dá)的FasL也可能參與了輔助性T細(xì)胞(helper T cell，Th)亞群的調(diào)節(jié)，但對(duì)CTL本身可能沒有作用；此外，TNF-β也是參與CTL損傷骨髓造血靶細(xì)胞的重要效應(yīng)因子，在SAA患者CD8+HLA-DR+效應(yīng)T細(xì)胞的表達(dá)也增高。因此，上述三種途徑可能均在SAA免疫發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用。
　　(2)SAA初治患者CD8+HLA-DR+效應(yīng)T細(xì)胞能夠明顯增加緩解患者及

14、正常人骨髓造血靶細(xì)胞凋亡率，提示CD8+HLA-DR+效應(yīng)T細(xì)胞在SAA骨髓免疫損傷中機(jī)制中居于重要地位。而緩解SAA患者CD8+HLA-DR+效應(yīng)T細(xì)胞功能并未降至正常，臨床應(yīng)用免疫抑制治療中應(yīng)注重足量、足療程給藥，以便徹底控制患者異常免疫狀態(tài)，防止復(fù)發(fā)。
　　(3)SAA初治患者CD8+HLA-DR+效應(yīng)T細(xì)胞能夠誘導(dǎo)正常人CD34+、CD33+、CD14+細(xì)胞凋亡增加，對(duì)正常的骨髓造血干/祖、粒系、單核系細(xì)胞均具有殺傷作用；