供體脾淋巴細胞輸注及FK506對同種異體小鼠心臟移植急性排斥反應的影響.pdf

1、【背景】
　　器官移植是很多臟器疾病終末期的唯一有效方法，但是移植排斥反應是移植后影響臟器功能正常發(fā)揮和受者長期存活的關鍵因素之一。化學免疫抑制劑如環(huán)孢素A(cyclosporine,CsA)和普樂可復(Prograf，Tacrolimus，FK506)等先后應用，器官移植得到巨大發(fā)展。然而，現有的免疫抑制劑抑制排斥反應的劑量，在一定程度上，也限制了機體對感染和腫瘤的免疫反應。因此，抑制劑的自身毒副作用影響了其自身的長期使用。組合

2、使用免疫抑制方法已被用來減輕藥物的毒副作用。在心臟移植術前給予供體特異輸注(donor-specific transfusion，DST)預先處理，可減少免疫抑制劑的劑量，又能延長移植物的生存。
　　FK506(tacrolimus)是1984年日本藤澤制藥公司的科學家發(fā)現的一種強力選擇性大環(huán)內酯類免疫抑制劑。體外實驗結果表明，FK506抗移植排斥反應作用是環(huán)孢素A的10～100倍，可減少器官移植接受者的激素用量。1993年以來，

3、國際上已有70余個國家將FK506臨床用于肝、腎、心臟等器官移植后的抗排斥反應治療。1989年美國肝臟移植專家Starzl首次將FK506用于肝臟移植，1994年美國國家醫(yī)藥食品管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準用于肝臟移植，1997年批準用于腎移植。2006年3月30日，FDA批準FK506用于心臟移植。普樂可復的毒副作用主要有震顫、頭痛、睡眠障礙、高血壓、腎功減退和糖耐量降低。
　　

4、【目的】
　　研究在術前一天進行供體特異輸注(donor-specific transfusion,DST)及不同劑量FK506對同種異體小鼠心臟移植急性排斥反應的影響。初步探討尋找合適的免疫抑制劑劑量，為臨床應用及進一步研究提供實驗依據。
　　【方法】
　　1、脾淋巴懸液的制備：以BALB/C小鼠取脾后，在無菌皿內加5mlEZ-Sep TM Mouse 1X淋巴細胞分離液(使用前搖勻)，在200目一次性尼龍網上用針芯

5、研磨成均勻胞漿。后取約1×107個細胞，加入1mlPBS液待用。
　　2、供體特異輸注：各組C57BL/6受體于術前1天供體特異輸注(DST)1次，輸注劑量為0.5ml(5×106個)脾細胞，尾靜脈注射入靜脈系統(tǒng)。
　　3、模型建立：按Chen方法進行，就是在戊巴比妥鈉40-50mg/kg腹腔麻醉的條件下將供體BALB/C小鼠心臟的無名動脈和肺動脈分別與受體C57BL/6的頸內動脈和頸外靜脈進行端端吻合，植入頸部皮下。

6、>　　4、DST及FK506對同種異體小鼠心臟移植的影響：將受體C57BL/6小鼠隨機分成4組，每組10只進行實驗：
　?、佟⒌?組：即對照組，對受體無任何處理，即直接心臟移植；
　　②、第2組：DST組，術前1d單純給予受體DST；
　?、邸⒌?組：DST+FK506(2mg/kg/d)組，術前1d給予受體DST，加較大劑量FK506(2mg/kg/d)；
　?、?、第4組：DST+FK506(0.3mg/kg/

7、d)組，術前1d給予受體DST，加較小劑量FK506(0.3mg/kg/d)。第3組和第4組均從手術當天開始給予FK506，每日一次，腹腔注射，到供心停跳或者移植后40天停止。
　　5、術后處理與觀察：術后小鼠盡快復溫，獨籠飼養(yǎng)。
　?、?、每天通過視診和觸診檢測移植心情況，早期(72h)出現心跳緩慢無力或心跳停止，視為手術失敗；受體與移植心存活超過72h，認為手術成功。移植心跳動停止視為排斥終點。
　?、凇⒏鹘M分別于移

8、植后7天取移植心臟作常規(guī)病理學處理，HE染色光鏡下檢查，對急性排斥反應強度的分級參照Stanford標準進行分級。
　?、?、移植后7天檢測血清白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)及干擾素-γ(IFN-γ)水平的變化，按ELISA試劑盒說明書進行。
　　④、在心臟移植后15d，取DST+FK506(2mg/kg/d)組、DST+FK506(0.3mg/kg/d)組受體的脾細胞做MLR，以正

9、常C57BL/6小鼠脾細胞為對照，分別測定對供體BALB/C小鼠及第三方C3H小鼠脾細胞的單向混合淋巴細胞反應(Mixed lymphocyte reaction,MLR)。
　　【結果】
　　1、移植心存活時間：統(tǒng)計數據分析用SPSS軟件。生存數據分析用Kaplan-Meier生存分析和Log-Rank檢驗。Log-Rank檢驗比較結果顯示，DST+FK506(2mg/kg/d)組及DST+FK506(0.3mg/kg/d

10、)組其生存時間比DST組及對照組明顯延長，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析以DST+FK506(0.3mg/kg/d)組顯著延長移植物的生存，可見DST加較小劑量FK506延長移植物生存效果最好。
　　2、病理學觀查：移植術后第7天，第1組（對照組）有大量淋巴細胞、單核細胞浸潤，大片心肌變性、壞死，心肌血管充血，血管內膜增厚，屬于急性排斥分級第4級；第2組（DST組）有較多淋巴細胞，小片心肌變性、

11、壞死，屬于急性排斥分級第3級；第3組（DST+FK506(2mg/kg/d)組）有中等量淋巴細胞浸潤，單灶狀心肌變性、壞死，心肌水腫較輕，屬于分級第2級；第4組（DST+FK506(0.3mg/kg/d)組）有中等量炎細胞浸潤，有少量單核細胞、淋巴細胞浸潤，心肌壞死數目較少，屬于分級第2級。
　　3、細胞因子檢測：術后第7天，血清中細胞因子檢測結果顯示，第3組和第4組IL-2和IFN-γ水平均低于其他兩組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0

12、.01)。血清第3組和第4組IL-4和IL-10高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，且第3組高于第4組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。
　　4、單向混合淋巴細胞反應：在心臟移植后15d，DST+FK506(2mg/kg/d)組和DST+FK506(0.3mg/kg/d)組C57BL/6小鼠脾細胞針對供體BALB/C小鼠抗原均表現出顯著低反應性(與MLR正常對照組相比差異有統(tǒng)計學意義，均為P<0.01)，同時對第三方C

13、3H小鼠脾細胞也表現出低反應性(與MLR正常對照組相比差異有統(tǒng)計學意義，均為P<0.01)。
　　【結論】
　　1.成功的建立了小鼠頸部異位心臟急性排斥反應的模型，術后移植心臟復跳較快，手術成功率較高。
　　2.脾淋巴懸液的制備對DST干預有重要的影響。本實驗的研磨脾臟方法獲得足夠的細胞數進行DST預處理，減少非淋巴細胞雜質。
　　3.FK506和DST的聯合使用，對小鼠異位心臟移植的急性排斥反應有明顯的抑制，顯