趨化因子受體途徑阻斷對(duì)同種異體胰島移植急性排斥反應(yīng)的影響.pdf

1、胰島移植是治療糖尿病的有效手段之一。胰島移植安全、可靠，并發(fā)癥少，它不僅可以有效降低血糖，而且可以減緩、防止甚至逆轉(zhuǎn)糖尿病慢性血管病變，在很大程度上改善病人依靠胰島素治療不能糾正的免疫缺損狀況。但是移植后急性排斥反應(yīng)嚴(yán)重影響移植胰島的功能，如何預(yù)防和控制排斥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展，仍是亟待解決的問題。趨化因子是一類控制免疫細(xì)胞定向遷移的細(xì)胞因子，對(duì)白細(xì)胞的發(fā)育、分化、定位具有重要的調(diào)節(jié)作用。研究顯示趨化因子及其受體介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在急性排斥反應(yīng)

2、中具有重要作用。肽核酸是一種核酸類似物，它是由2氨基乙基甘氨酸蛋白骨架取代核酸的磷酸戊糖，可以高度特異地與所選基因序列的靶點(diǎn)結(jié)合。肽核酸能高親和性、高特異性地與DNA或RNA雜交形成穩(wěn)定雙螺旋或三螺旋結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)擬應(yīng)用反義肽核酸阻斷CC趨化因子受體5(CCR5)和CXC趨化因子受體3(CXCR3)作用途徑，研究其對(duì)同種異體胰島移植急性排斥反應(yīng)的影響及其作用機(jī)制。 材料和方法:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用昆明小鼠(沈陽藥科大學(xué)動(dòng)物中心提供)作為供

3、體，體重(30±2)g，雌雄不限，受者為C57小鼠，體重(30±2)g。 糖尿病小鼠模型制備：移植前14天，采用鏈脲霉素化學(xué)灼傷法制備糖尿病小鼠模型(腹腔內(nèi)注射2％STZ，150mg/kg體重)。監(jiān)測隨機(jī)血糖，如連續(xù)3天在非禁食情況下，血糖＞16.8mmol/L，即為糖尿病模型。 胰島分離純化：采用明尼蘇達(dá)大學(xué)改良方法，原位灌注消化、密度梯度分離純化胰島。應(yīng)用含冷卻的膠原酶(膠原酶V型，1.5mgml)的Hank’s緩沖

4、液2-4ml灌注胰腺，切取胰腺。37℃水浴消化12-15min。低溫(8℃，800rpm，2min)清洗細(xì)胞2次。采用密度梯度離心純化胰島，介質(zhì)濃度分別為25％、23％、20.5％、11％Ficoll。 胰島移植模型建立：倒置顯微鏡下手檢計(jì)數(shù)300當(dāng)量胰島(1當(dāng)量相當(dāng)于1個(gè)直徑100μm以上胰島)。10μl長吸頭移液器管嘴吸取胰島，將細(xì)胞離心(1000rpm，3min)至尖端吸頭處。糖尿病小鼠經(jīng)右側(cè)脊柱旁切口暴露右側(cè)腎臟。于右腎

5、下極被膜處作一長約2mm的切口，緩慢將移液器中的胰島推入。 實(shí)驗(yàn)一：根據(jù)不同處理因素將胰島移植受者隨機(jī)分4組：生理鹽水組；CCR5反義肽核酸組(序列：5’-Tyr-CCGTTCTGACTTTT-Lys-3’421)；CXCR3反義肽核酸組(序列：8845’-Tyr-ACGTGGCTTTTTCG-Lys3’871)；隨機(jī)肽核酸組(序列：Tyr-TTTCCAGCTGCTTT-Lys)。反義肽核酸從術(shù)日起至術(shù)后第6天，每日經(jīng)尾靜脈注射

6、，劑量為2.5mg/kg。生理鹽水組每日注射0.1ml生理鹽水。移植后監(jiān)測非空腹血糖，低于11.2mmol/1，作為移植物存活的標(biāo)準(zhǔn)。移植后非空腹血糖連續(xù)2天高于11.2mmol/1，以第一時(shí)間作為移植物受排斥、功能喪失的指標(biāo)。判斷移植物存活時(shí)間。排斥反應(yīng)時(shí)或術(shù)后第7天切取5只小鼠含有胰島移植物的部分腎臟、脾臟、血液標(biāo)本進(jìn)行檢測。提取移植物RNA和蛋白，半定量分析CCR5、CXCR3及相應(yīng)配體mRNA水平和CCR5、CXCR3蛋白水平。

7、同時(shí)留取正常小鼠腎臟檢測CCR5、CXCR3mRNA水平。制備脾細(xì)胞懸液，應(yīng)用雙色流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測T淋巴細(xì)胞CCR5、CXCR3的表達(dá)。采用微量全血3H-TdR摻入法檢測T淋巴細(xì)胞增殖能力。同時(shí)，移植物標(biāo)本進(jìn)行HE染色及Insulin免疫組化染色，觀察組織形態(tài)學(xué)改變。 實(shí)驗(yàn)二：根據(jù)不同處理因素胰島移植受體隨機(jī)分3組：生理鹽水組：每日尾靜脈注射0.1ml生理鹽水；CCR5反義肽核酸(PNACCR5)組：術(shù)日起至術(shù)后第6天，每日

8、經(jīng)尾靜脈注射，劑量為2.5mg/kg；CCR5反義肽核酸聯(lián)合應(yīng)用低劑量雷帕霉素組：除應(yīng)用PNACCR5外，同時(shí)采用管飼法于術(shù)日至術(shù)后第6天，每日給予低劑量雷帕霉素(0.2mg/kg)。移植后監(jiān)測非空腹血糖，低于11.2mmol/L，作為移植物存活的標(biāo)準(zhǔn)。移植后非空腹血糖連續(xù)2天高于11.2mmol/L，以第一時(shí)間作為移植物受排斥、功能喪失的指標(biāo)。判斷移植物存活時(shí)間。排斥反應(yīng)時(shí)或術(shù)后第7天共留取5只小鼠含有胰島移植物的部分腎臟、脾臟、血液

9、標(biāo)本進(jìn)行檢測。提取移植物RNA和蛋白，監(jiān)測IL-2、IFN-γIL-10mRNA水平和CCR5蛋白水平。采用微量全血3H-TdR摻入法檢測T淋巴細(xì)胞增殖能力。同時(shí)，移植物標(biāo)本進(jìn)行HE染色及Insulin免疫組化染色，觀察組織形態(tài)學(xué)改變。 所有數(shù)據(jù)以(x)±s表示，采用One-WayANOVA方法檢驗(yàn)。胰島移植物生存時(shí)間應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線分析，采用Log-rank進(jìn)行檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有數(shù)據(jù)均

10、通過SPSS10.0軟件處理。 結(jié)果實(shí)驗(yàn)一：生理鹽水組胰島移植2天后血糖有所下降，但之后再次升高，移植物平均存活時(shí)間(6.50±0.58)天。PNACCP5組小鼠于胰島移植后3天空腹血糖恢復(fù)正常，移植胰島平均存活時(shí)間(12.00±1.75)天。PNACX-CR3組、隨機(jī)PNA組移植物平均存活時(shí)間分別為(9.70±1.000天、(6.50±0.50)天。PNACCR5組和PNACXCR3組移植物平均存活時(shí)間明顯長于生理鹽水組和隨機(jī)

11、PNA組，差異顯著。PNACCR5組和PNACXCR3組相比，移植物存活時(shí)間無明顯差別(P＞0.05)。正常小鼠CCR5mRNA低水平表達(dá)，發(fā)生排斥反應(yīng)時(shí)相對(duì)表達(dá)量顯著升高為1.83±0.09，兩組比較差異顯著(P＜0.01)。正常小鼠CXCR3mRNA低水平表達(dá)，排斥反應(yīng)時(shí)升高。術(shù)后第7天或急性排斥反應(yīng)時(shí)檢測移植物內(nèi)CCR5、CXCR3及其配體mR-NA表達(dá)，PNACCR5組CCR5mRNA水平明顯下調(diào)，同生理鹽水對(duì)照組和隨機(jī)PNA組

12、比較，差異顯著(P＜0.01)。PNACXCR3組CXCR3mRNA水平明顯下調(diào)，同生理鹽水對(duì)照組和隨機(jī)PNA組比較，差異顯著(P＜0.01)。PNACCR5組和PNACXCR3組，RANTES、MIP-1α、IP-10和Mig水平較對(duì)照組無明顯降低。WesternBlotting結(jié)果顯示PNACCR5明顯且特異地降低CCR5蛋白分泌，同生理鹽水組和隨機(jī)PNA組比較，差異顯著(P＜0.01)。PNACXCR3中度下調(diào)CXCR3蛋白表達(dá)。

13、PNACCR5組脾CD3+T細(xì)胞CCR5表達(dá)率明顯下降，表達(dá)率0.32±0.03，PNACXCR3組脾CD3+T細(xì)胞CXCR3表達(dá)率下降。檢測術(shù)后第7天受者淋巴細(xì)胞增殖能力，各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P＞0.05)。生理鹽水組和隨機(jī)PNA組HE染色胰島移植物周圍可見大量淋巴細(xì)胞浸潤，Insulin染色著色淺。PNACCR5和PNACXCR3組小鼠腎被膜下胰島移植物周圍淋巴細(xì)胞浸潤少見，Insulin免疫組化染成棕黃色，證實(shí)確為有功能的胰島。

14、 實(shí)驗(yàn)二：生理鹽水對(duì)照組、PNACCR5組和PNACCR5聯(lián)合應(yīng)用低劑量雷帕霉素組移植胰島存活時(shí)間分別為(6.50±0.58)天，(12.00±1.75)天，(16.20±3.13)天。聯(lián)合應(yīng)用組與單獨(dú)PNACCR5組相比，存活時(shí)間明顯延長(P＜0.05)。與對(duì)照組相比，單獨(dú)PNACCR5組和聯(lián)合治療組IFN-γmRNA表達(dá)水平降低(P＜0.01)。單獨(dú)PNACCR5組和聯(lián)合治療組比較，兩者無差別(P＞0.05)；聯(lián)合應(yīng)用組和PN

15、ACCR5組IL-2mRNA水平均較對(duì)照組降低，差異顯著(P＜0.01)；聯(lián)合應(yīng)用組IL-10mRNA水平較PNACCR5組升高，差異明顯(P＜0.01)。顯示雷帕霉素與PNACCR5有協(xié)同作用，并使同種異體胰島移植受者細(xì)胞因子分泌格局從Th1型向Th2型細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化。絲裂原刺激的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)顯示，聯(lián)合應(yīng)用組淋巴細(xì)胞增殖能力降低，同PNACCR5組和生理鹽水組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01，P＜0.05)。PNACCR5和聯(lián)合應(yīng)

16、用組小鼠腎被膜下區(qū)增厚，胰島移植物周圍淋巴細(xì)胞浸潤少見，Insulin免疫組化染成棕黃色，證實(shí)確為有功能的胰島。 結(jié)論1.CCR5和CXCR3反義肽核酸能夠特異、顯著的降低移植物CCR5、CXCR3mRNA表達(dá)和蛋白分泌。 2.CCR5和CXCR3反義肽核酸下調(diào)CD3+T淋巴細(xì)胞CCR5、CXCR3的表達(dá)，抑制淋巴細(xì)胞活化，但對(duì)淋巴細(xì)胞增殖能力無明顯影響。 3.CCR5和CXCR3反義肽核酸能夠延長同種異體胰島移