大鼠同種異體腎移植排斥反應蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、目的：建立同種異體大鼠左腎移植模型，觀察移植腎形態(tài)學改變；應用蛋白質(zhì)組學技術測定在腎移植術后移植腎組織的蛋白質(zhì)組變化，找出不同時間段蛋白質(zhì)組變化的信息數(shù)據(jù)，分析移植腎動態(tài)變化的差異蛋白質(zhì)，確定腎移植術后免疫排斥反應發(fā)生相關的特異蛋白，以期尋找新的生物靶點，更深入地闡明腎移植術后免疫排斥反應發(fā)生、發(fā)展的可能機制。
　　方法：
　　(1)建立大鼠左腎原位異體移植模型。以近交系雄性Lewis大鼠作為異基因移植組受體，近交系雄性F3

2、44大鼠作為同基因移植組供、受體與異基因移植組供體。分為3組：正常對照組(同基因移植組)；急性排斥反應組(異基因移植術后1周)；慢性排斥反應組(異基因移植術后12周)。慢性排斥反應組術后環(huán)孢素灌胃10mg/(kg·d)，連續(xù)10d。并于術后第10d切除受體右腎。分組喂養(yǎng)，按照規(guī)定時間獲取移植腎標本，行形態(tài)學觀察。
　　(2)移植腎組織的蛋白質(zhì)組學分析。利用雙向凝膠電泳(Two-dimensional electrophoresis

3、，2-DE)分離大鼠移植后腎組織的總蛋白質(zhì)，經(jīng)酸性硝酸銀法染色后經(jīng)圖像分析識別差異蛋白質(zhì)，再應用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)分析獲得差異表達蛋白的肽指紋圖譜，并用Mascot軟件在進行搜索、分析確定差異表達的蛋白；采用免疫組織化學方法、ELISA、RT-

4、PCR、Western blot等方法對差異蛋白進行驗證。
　　結(jié)果：
　　(1)8個月共完成125次大鼠左腎原位腎移植手術，其中前期75次，主要是探索手術方法和訓練顯微外科技術，總結(jié)圍手術期處理經(jīng)驗。后期50次，手術時間(130±16)min，熱缺血時間小于30s，冷缺血時間小于50min，手術成功率86.0％。
　　(2)術后形態(tài)學觀察：對照組組織結(jié)構(gòu)基本正常，可見腎間質(zhì)輕度水腫，炎性細胞浸潤少見；腎小管上皮細胞未

5、見明顯變性、壞死、脫落；不伴出血及血栓形成，無明顯腎間質(zhì)纖維化；腎小球形態(tài)基本正常，未見硬化及萎縮；血管內(nèi)膜可有輕度增生，但無玻璃樣變性。急性排斥反應組(術后1周)腎間質(zhì)可見在腎小管和毛細血管周圍彌漫性炎性細胞浸潤，浸潤的炎性細胞以淋巴細胞居多；同時可見腎小管上皮細胞變性、壞死、脫落；伴出血及血栓形成，并可見動脈壁纖維素變性、壞死。慢性排斥反應組(術后12周)見腎小球基底膜明顯增厚、腎小球硬化萎縮，伴毛細血管內(nèi)膜明顯增生、玻璃樣變性，可

6、伴出血及血栓形成、甚至閉塞；同時腎小管細胞發(fā)生明顯變性、甚至萎縮退化；而腎間質(zhì)可出現(xiàn)廣泛的纖維化，且常伴較多的炎癥細胞浸潤，以淋巴細胞、單核細胞居多。
　　(3)得到了分辨率較高、重復性較好移植腎組織雙向凝膠電泳圖譜(17cm IPG膠條，pH3-10)；急性排斥反應組、慢性排斥反應組和對照組蛋白斑點數(shù)量分別為554±34、583±42和542±21個。
　　(4)急性排斥反應組和慢性排斥反應組分別與對照組比較，分別發(fā)現(xiàn)37

7、個和22蛋白點的表達水平發(fā)生顯著變化。
　　(5)對前者37個差異蛋白點進行了肽質(zhì)指紋圖譜分析，29個點得到較滿意的肽質(zhì)量指紋圖，用Mascot軟件在SwissProt數(shù)據(jù)庫中進行搜索，鑒定出6個差異的蛋白。對后者22個差異蛋白點進行了肽質(zhì)指紋圖譜分析，19個點得到較滿意的肽質(zhì)量指紋圖，用Mascot軟件進行搜索，鑒定出4個差異的蛋白。
　　(6)免疫組織化學方法、ELISA、RT-PCR、Western blot等證實PD