大鼠同種異體腎移植排斥反應(yīng)蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的：建立同種異體大鼠左腎移植模型，觀察移植腎形態(tài)學(xué)改變；應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)測(cè)定在腎移植術(shù)后移植腎組織的蛋白質(zhì)組變化，找出不同時(shí)間段蛋白質(zhì)組變化的信息數(shù)據(jù)，分析移植腎動(dòng)態(tài)變化的差異蛋白質(zhì)，確定腎移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)發(fā)生相關(guān)的特異蛋白，以期尋找新的生物靶點(diǎn)，更深入地闡明腎移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)發(fā)生、發(fā)展的可能機(jī)制。
　　方法：
　　(1)建立大鼠左腎原位異體移植模型。以近交系雄性Lewis大鼠作為異基因移植組受體，近交系雄性F3

2、44大鼠作為同基因移植組供、受體與異基因移植組供體。分為3組：正常對(duì)照組(同基因移植組)；急性排斥反應(yīng)組(異基因移植術(shù)后1周)；慢性排斥反應(yīng)組(異基因移植術(shù)后12周)。慢性排斥反應(yīng)組術(shù)后環(huán)孢素灌胃10mg/(kg·d)，連續(xù)10d。并于術(shù)后第10d切除受體右腎。分組喂養(yǎng)，按照規(guī)定時(shí)間獲取移植腎標(biāo)本，行形態(tài)學(xué)觀察。
　　(2)移植腎組織的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。利用雙向凝膠電泳(Two-dimensional electrophoresis

3、，2-DE)分離大鼠移植后腎組織的總蛋白質(zhì)，經(jīng)酸性硝酸銀法染色后經(jīng)圖像分析識(shí)別差異蛋白質(zhì)，再應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)分析獲得差異表達(dá)蛋白的肽指紋圖譜，并用Mascot軟件在進(jìn)行搜索、分析確定差異表達(dá)的蛋白；采用免疫組織化學(xué)方法、ELISA、RT-

4、PCR、Western blot等方法對(duì)差異蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果：
　　(1)8個(gè)月共完成125次大鼠左腎原位腎移植手術(shù)，其中前期75次，主要是探索手術(shù)方法和訓(xùn)練顯微外科技術(shù)，總結(jié)圍手術(shù)期處理經(jīng)驗(yàn)。后期50次，手術(shù)時(shí)間(130±16)min，熱缺血時(shí)間小于30s，冷缺血時(shí)間小于50min，手術(shù)成功率86.0％。
　　(2)術(shù)后形態(tài)學(xué)觀察：對(duì)照組組織結(jié)構(gòu)基本正常，可見(jiàn)腎間質(zhì)輕度水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)少見(jiàn)；腎小管上皮細(xì)胞未

5、見(jiàn)明顯變性、壞死、脫落；不伴出血及血栓形成，無(wú)明顯腎間質(zhì)纖維化；腎小球形態(tài)基本正常，未見(jiàn)硬化及萎縮；血管內(nèi)膜可有輕度增生，但無(wú)玻璃樣變性。急性排斥反應(yīng)組(術(shù)后1周)腎間質(zhì)可見(jiàn)在腎小管和毛細(xì)血管周圍彌漫性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞以淋巴細(xì)胞居多；同時(shí)可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落；伴出血及血栓形成，并可見(jiàn)動(dòng)脈壁纖維素變性、壞死。慢性排斥反應(yīng)組(術(shù)后12周)見(jiàn)腎小球基底膜明顯增厚、腎小球硬化萎縮，伴毛細(xì)血管內(nèi)膜明顯增生、玻璃樣變性，可

6、伴出血及血栓形成、甚至閉塞；同時(shí)腎小管細(xì)胞發(fā)生明顯變性、甚至萎縮退化；而腎間質(zhì)可出現(xiàn)廣泛的纖維化，且常伴較多的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞居多。
　　(3)得到了分辨率較高、重復(fù)性較好移植腎組織雙向凝膠電泳圖譜(17cm IPG膠條，pH3-10)；急性排斥反應(yīng)組、慢性排斥反應(yīng)組和對(duì)照組蛋白斑點(diǎn)數(shù)量分別為554±34、583±42和542±21個(gè)。
　　(4)急性排斥反應(yīng)組和慢性排斥反應(yīng)組分別與對(duì)照組比較，分別發(fā)現(xiàn)37

7、個(gè)和22蛋白點(diǎn)的表達(dá)水平發(fā)生顯著變化。
　　(5)對(duì)前者37個(gè)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行了肽質(zhì)指紋圖譜分析，29個(gè)點(diǎn)得到較滿意的肽質(zhì)量指紋圖，用Mascot軟件在SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行搜索，鑒定出6個(gè)差異的蛋白。對(duì)后者22個(gè)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行了肽質(zhì)指紋圖譜分析，19個(gè)點(diǎn)得到較滿意的肽質(zhì)量指紋圖，用Mascot軟件進(jìn)行搜索，鑒定出4個(gè)差異的蛋白。
　　(6)免疫組織化學(xué)方法、ELISA、RT-PCR、Western blot等證實(shí)PD