大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)的淋巴細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用雙向凝膠電泳并結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)對(duì)大鼠肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)模型的淋巴細(xì)胞進(jìn)行研究，篩選、分析發(fā)生表達(dá)變化的蛋白質(zhì)，以期了解與排斥反應(yīng)相關(guān)的特異性蛋白質(zhì)及它們之間的相互關(guān)系，從蛋白質(zhì)水平揭示淋巴細(xì)胞在肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)中的分子機(jī)制。 基于上述考慮，首先建立大鼠異種基因肝移植的急性排斥動(dòng)物模型，分離出模型大鼠脾臟的淋巴細(xì)胞，利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定急性排斥反應(yīng)的相關(guān)功能蛋白，擬對(duì)肝移植急性排斥反應(yīng)的分子機(jī)制從蛋白質(zhì)水平進(jìn)行系

2、統(tǒng)研究。本部分研究的具體內(nèi)容總結(jié)如下： 第一部分：改良Kamada法大鼠原位肝移植模型的建立 方法：利用改良Kamada法建立穩(wěn)定的大鼠原位肝移植動(dòng)物模型，模型的建立是本項(xiàng)研究的基礎(chǔ)。我們采用該方法對(duì)113只大鼠進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)練習(xí)，通過(guò)總結(jié)失敗原因，試驗(yàn)組的110只大鼠手術(shù)成功率和1周存活率（90.9%）明顯提高。 結(jié)果：所有數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0軟件完成，利用x2檢驗(yàn)比較兩組術(shù)后1周生存率有顯著性差異。試驗(yàn)組

3、肝上下腔靜脈的吻合時(shí)間為10～15分鐘，無(wú)肝期為18～20分鐘。術(shù)后常見的并發(fā)癥為腹腔出血、肝下下腔靜脈狹窄血栓形成、左膈下靜脈出血、膽管梗阻、門靜脈狹窄血栓形成、感染、麻醉過(guò)深以及呼吸衰竭。小結(jié)：大鼠肝移植模型是一種難度較大的手術(shù)，術(shù)中供肝的游離、灌注、冷保存，套管，受體肝臟的游離、切除、供肝置入受體后血管的吻合以及大鼠活力、解剖結(jié)構(gòu)和變異等各個(gè)環(huán)節(jié)都會(huì)影響大鼠肝移植術(shù)后的存活率。我們不僅需要形成標(biāo)準(zhǔn)化的手術(shù)操作流程，而且需要術(shù)中仔細(xì)

4、、輕柔的操作和熟練的顯微外科技術(shù)。 歸納起來(lái)，我們將大鼠肝移植模型制作預(yù)防并發(fā)癥的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)如下：（1）重視早期動(dòng)物模型的預(yù)試驗(yàn)操作，細(xì)致熟練的顯微外科技術(shù)是預(yù)防術(shù)中、術(shù)后并發(fā)癥的先決條件；（2）麻醉的深淺控制是手術(shù)成功的保障；（3）盡量縮短受體無(wú)肝期是決定術(shù)后生存率的關(guān)鍵；（4）改善術(shù)后飼養(yǎng)環(huán)境及合理的抗菌素應(yīng)用是預(yù)防術(shù)后感染的必要手段。 第二部分：移植肝血清IL-2與IFN-γ水平檢測(cè)及組織切片分析 方法：在前

5、期動(dòng)物模型制作的基礎(chǔ)上，選取10周齡Wistar大鼠6只，10周齡SD大鼠18只，體重250～300g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔飼養(yǎng)，術(shù)前禁食12 h，自由飲水。Wistar大鼠作為異基因移植組供體，SD大鼠作為同基因移植組供、受體與異基因移植組受體。將6只Wistar大鼠和18只SD大鼠分成兩組。第一組：急性排斥反應(yīng)組（從Wistar大鼠移植到SD大鼠，6對(duì)）；第二組：同基因移植對(duì)照組（從SD大鼠移植到SD大鼠，6對(duì)）。手術(shù)采用吸入乙醚麻醉，大鼠

6、肝移植模型采用改良Kamada“雙袖套法”，不吻合肝動(dòng)脈。手術(shù)均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。抽取同基因移植對(duì)照組與急性排斥組肝移植后SD大鼠血清樣本。血清IL-2與IFN-γ水平分別用大鼠IL-2與IFN-γ ELISA試劑盒測(cè)定。移植后的肝組織用10%福爾馬林，4℃固定過(guò)夜，石蠟包埋，切片厚度為4μm，經(jīng)HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化。 結(jié)果：兩組大鼠術(shù)后均正常存活，第3d處死時(shí)未見血管或膽道并發(fā)癥。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分

7、析。與同基因?qū)φ战M的大鼠[IL-2：（15.36±1.07）pg/L； IFN-γ：（158.76±21.42）pg/L]相比，急性排斥組的大鼠血清IL-2[（132.43±1.20）pg/L]與IFN-γ[（809.44±123.01）pg/L]的水平表達(dá)顯著增加（P<0.05）。排斥組肝組織HE染色切片證實(shí)均有Ⅱ a～Ⅱ b級(jí)（Banff標(biāo)準(zhǔn)）排斥反應(yīng)表現(xiàn)，而對(duì)照組肝組織HE染色切片未見排斥反應(yīng)表現(xiàn)。 小結(jié)：將Wistar大

8、鼠肝臟移植到SD大鼠可成功誘導(dǎo)出大鼠急性排斥反應(yīng)的動(dòng)物模型。異體器官移植排異反應(yīng)與受者的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)密切相關(guān)，有較多研究表明，Th1細(xì)胞因子如干擾素（IFN）、白介素（IL）-2等參與器官移植排異反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中，急性排斥組的大鼠血清IL-2與IFN-γ的水平表達(dá)顯著增加。排斥組肝組織HE染色切片證實(shí)均有Ⅱ a～Ⅱ b級(jí)（Banff標(biāo)準(zhǔn)）排斥反應(yīng)表現(xiàn)，而對(duì)照組肝組織HE染色切片未見排斥反應(yīng)表現(xiàn)。 第三部分：淋巴細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品的制備

9、及雙向凝膠電泳分離蛋白質(zhì) 方法：將脾切成碎塊，放入勻漿器，加入少許RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基，反復(fù)研磨，將組織研磨成為勻漿，將組織勻漿轉(zhuǎn)移至潔凈燒杯中，用裝有1ml注射器針頭的10ml注射器反復(fù)吹打，使組織勻漿形成單個(gè)細(xì)胞。在15ml離心管中加入與組織勻漿等體積的HISTOPAQUE-1077淋巴細(xì)胞分離液，然后小心將組織勻漿加入淋巴細(xì)胞分離液上層，400 g/min離心30 min，分離出淋巴細(xì)胞，再用RPMI1640培養(yǎng)基洗

10、滌細(xì)胞三次，離心后小心用濾紙將上清吸干，將獲得的淋巴細(xì)胞置液氮中保存。按照100 mg干重淋巴細(xì)胞400Ll裂解液的比例混勻，置4℃裂解30分鐘后，離心30分鐘，取上清分裝，用2D QUANT蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量，分別對(duì)兩組蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行組內(nèi)等量混合，分裝凍存于液氮。用前經(jīng)再次對(duì)蛋白質(zhì)定量后，各取同基因移植對(duì)照組和移植急性排斥組淋巴細(xì)胞蛋白質(zhì)300μg，分別與適量泡脹緩沖液混勻，總?cè)萘繛?40μl，加入膠條槽，以24cm，pH3～10

11、的IPG干膠條覆蓋，置于IPGphor水平電泳儀電極板上，在20℃，每膠50 mA的條件下等電聚焦電泳，總電壓時(shí)間積約為53，000 Vh；然后平衡膠條各10分鐘，置12.5% SDS凝膠進(jìn)行垂直電泳分離，以Coomassie bri12liant blue G2250對(duì)凝膠做膠體考染，用超純水脫色至干凈。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用Image Scanner掃描儀以及Lab Scan掃描軟件掃描凝膠，獲取300dpi分辨率圖像，以ImageM

12、aster2D Elite圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析，經(jīng)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)檢測(cè)、標(biāo)準(zhǔn)化和匹配做差異分析后得出差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的數(shù)據(jù)信息，采用t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。與對(duì)照組相比，差異蛋白表達(dá)水平比值變化超過(guò)1.5倍以上的被認(rèn)為有意義的差異點(diǎn)并被選取用來(lái)質(zhì)譜分析。對(duì)質(zhì)譜分析得到的差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行Western blot驗(yàn)證。從各組提取30μg總蛋白后用12% SDS-PAGE膠分離，并轉(zhuǎn)至PVDF膜。隨后，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉PVDF膜1h。封閉結(jié)

13、束后，在搖床上與一抗4℃孵育過(guò)夜。孵育結(jié)束后，已經(jīng)結(jié)合一抗的PVDF膜用TBST溶液漂洗3次，接著與辣根過(guò)氧化酶偶聯(lián)的二抗溶液孵育1h，實(shí)驗(yàn)采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法。Western blot結(jié)束后的圖像由Image station2000R系統(tǒng)（美國(guó)Kodak公司）成像，并用生產(chǎn)商提供的軟件進(jìn)行分析。 結(jié)果：我們?cè)谇捌趧?dòng)物模型成功的基礎(chǔ)上，采用大鼠脾臟（最大的外周淋巴器官），分離出了高濃度、高質(zhì)量的淋巴細(xì)胞。大鼠肝組織蛋白質(zhì)的二維凝膠

14、電泳（2DE）圖像清晰，沒(méi)有背景條紋的干擾，蛋白質(zhì)斑點(diǎn)分離完全，在相同條件下，反復(fù)3次重復(fù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖大致相同，匹配率較高。以膠體考染的大鼠淋巴細(xì)胞蛋白質(zhì)凝膠能獲得300余個(gè)清晰的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，經(jīng)過(guò)比較分析篩選出25個(gè)表達(dá)量具有顯著差異的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，其中13個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)水平上調(diào)，與對(duì)照組相比比值變化超過(guò)1.5倍以上，而12個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)水平下調(diào)，其相應(yīng)比值變化超過(guò)至少1.5倍以上。經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析得到與免疫相關(guān)蛋白得到6個(gè)。雙向凝膠電泳分

15、析發(fā)現(xiàn)的25個(gè)差異點(diǎn)中，有6個(gè)蛋白質(zhì)參與細(xì)胞免疫反應(yīng)。對(duì)其中已知部分功能免疫相關(guān)的10條基因進(jìn)行分析，在表達(dá)上調(diào)的基因中，Y00480、AF084934、NM-013069及NM-013169是分別編碼主要組織相容性復(fù)合物（MHC）Ⅱ類分子α、β、γ多肽鏈（也稱恒定鏈或CL IP分子）和T淋巴細(xì)胞表面特異性抗原CD3分子δ多肽鏈的基因。靜息的T淋巴細(xì)胞表面僅表達(dá)MHCⅠ類抗原，活化的T淋巴細(xì)胞表面才表達(dá)MHCⅡ類抗原，MHCⅡ類相關(guān)基因

16、表達(dá)增加提示激活的T淋巴細(xì)胞明顯增加。CLIP分子占據(jù)MHCⅡ類分子的抗原結(jié)合溝，避免內(nèi)源性抗原肽結(jié)合，外源性抗原肽與CLIP分子交換，結(jié)合于抗原結(jié)合溝，表達(dá)MHC2抗原肽復(fù)合體。MHCⅡ類分子和CD3表達(dá)增加印證了MHC2抗原肽復(fù)合體/T淋巴細(xì)胞受體2CD3復(fù)合體在T淋巴細(xì)胞早期活化中的重要作用。補(bǔ)體因子1在急性排斥反應(yīng)中下調(diào)。補(bǔ)體因子1有降解補(bǔ)體C3b、C4b，抑制補(bǔ)體的作用，其基因（NM-024157）表達(dá)在急性排斥反應(yīng)中下調(diào)，提

17、示除細(xì)胞免疫外，體液免疫也參與此過(guò)程。 小結(jié)：脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，在機(jī)體的免疫應(yīng)答過(guò)程中起到了重要的作用。在同種移植免疫排斥反應(yīng)中，T淋巴細(xì)胞起著重要作用，參與了移植抗原的識(shí)別、免疫調(diào)節(jié)、溶細(xì)胞效應(yīng)等多層次免疫應(yīng)答。由于大鼠外周血內(nèi)淋巴細(xì)胞含量極少，難以收集出高濃度及重量的淋巴細(xì)胞。因此我們采用大鼠脾臟，可提取符合實(shí)驗(yàn)要求的淋巴細(xì)胞以備下一步實(shí)驗(yàn)待用。雙向凝膠電泳與質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)用是研究器官移植的有效手段。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以