大鼠肝臟再生的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、肝臟是功能復(fù)雜的消化器官，參與體內(nèi)蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂類等生物大分子的代謝、解毒、分泌等重要功能。所以肝臟極易受到外界有害物質(zhì)的損傷，但是它具有很強(qiáng)的再生功能，在正常生理狀態(tài)下或輕度肝損時(shí)肝細(xì)胞就已經(jīng)參與增殖和分化來(lái)維持肝臟的正常功能。肝臟再生與肝相關(guān)疾病密切相關(guān)，它不僅是判斷肝病嚴(yán)重程度的一種手段，在臨床上也是作為治療肝臟疾病的一種途徑，合并有脂肪肝、肝硬化等疾病的肝臟再生能力減弱，特別是肝硬化患者術(shù)后再生能力極差，肝臟功能不易恢復(fù)

2、導(dǎo)致肝功能衰竭發(fā)生率增高。而肝細(xì)胞癌也是由于在肝臟細(xì)胞再生過程中增生異常出現(xiàn)惡變。研究發(fā)現(xiàn)利用肝細(xì)胞在體內(nèi)旺盛的再生能力可有效實(shí)現(xiàn)受損肝組織功能修復(fù)和重建。如何選擇增生旺盛的肝細(xì)胞進(jìn)行移植以及如何促進(jìn)肝再生治療不同種肝臟相關(guān)疾病成為目前研究的熱點(diǎn)之一。因此，對(duì)肝臟再生進(jìn)行深入的研究，進(jìn)一步了解其機(jī)制，來(lái)指導(dǎo)臨床肝病的診治，對(duì)提高患者生存期具有極其重要的指導(dǎo)意義。 肝臟部分切除術(shù)是肝臟再生最常見的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停ㄟ^觀察肝臟部分切除術(shù)后

3、殘余肝臟基因、蛋白表達(dá)情況是了解肝臟再生機(jī)制的重要手段。其他的諸如門靜脈結(jié)扎術(shù)、門體靜脈分流術(shù)、直接補(bǔ)償性增生以及藥物誘導(dǎo)也是常用的肝臟再生實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。?shí)驗(yàn)動(dòng)物從小型動(dòng)物如鼠到大型動(dòng)物狗、豬等，它們?cè)谘芯扛闻K再生過程中各有優(yōu)缺點(diǎn)。一般根據(jù)所需實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩?lái)選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。 研究發(fā)現(xiàn)肝臟再生的發(fā)生發(fā)展是由體內(nèi)多基因參與、多步驟協(xié)同的復(fù)雜過程。盡管基因表達(dá)庫(kù)的分子研究方法描述了肝臟切除術(shù)后剩余肝臟迅速激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。并已鑒定出超過100

4、個(gè)瞬時(shí)基因參與肝臟再生，但是目前肝臟再生的分子機(jī)制仍不十分清楚，盡管所有的細(xì)胞都擁有同樣的基因組，但在不同的細(xì)胞內(nèi)會(huì)有不同的基因處在活躍狀態(tài)，從而合成不同的蛋白質(zhì)。同樣，不同細(xì)胞的差異在很大程度上也是由功能基因及其合成蛋白質(zhì)的不同來(lái)決定的，因而需要在整體水平上分析肝細(xì)胞內(nèi)蛋白的動(dòng)態(tài)變化。隨著后基因組時(shí)代的到來(lái)，以雙向電泳、質(zhì)譜分析為主的蛋白質(zhì)組學(xué)的方法和手段為肝臟研究提供了良好的技術(shù)平臺(tái)，蛋白質(zhì)組研究直接定位于蛋白質(zhì)水平，從整體、動(dòng)態(tài)、

5、定量的角度去研究肝臟再生過程中蛋白質(zhì)種類、數(shù)量的改變。有助于在分子水平上進(jìn)一步揭示肝臟再生的秘密。 本試驗(yàn)通過蛋白質(zhì)組的方法，對(duì)肝臟再生過程中的蛋白質(zhì)進(jìn)行比較分析，尋找肝臟再生過程中出現(xiàn)的差異蛋白，來(lái)獲取肝臟再生的影響因子，并對(duì)部分肝臟切除術(shù)及蛋白質(zhì)組學(xué)在研究肝臟再生上的應(yīng)用進(jìn)行評(píng)價(jià)。 一、肝臟再生模型的構(gòu)建和樣品蛋白的提純 目的運(yùn)用部分肝臟切除術(shù)來(lái)構(gòu)建肝臟再生模型，并使用Plusone2-Dclean-up試劑

6、盒來(lái)提純肝臟組織樣品蛋白，從而對(duì)部分肝臟切除術(shù)在肝臟再生上的應(yīng)用進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法SD大鼠行2/3肝臟切除術(shù)，術(shù)后提取肝臟蛋白使用Plusone2-Dclean-up試劑盒處理。處理前后的樣品分別進(jìn)行第一向等電聚焦，蛋白質(zhì)沿pH梯度分離至各自的等電點(diǎn)；再進(jìn)行第二向電泳，在沿垂直的方向進(jìn)行相對(duì)分子(molecular，Mr)質(zhì)量的分離，最后進(jìn)行銀染顯示蛋白的分布。比較處理前后的電泳圖譜。結(jié)果通過對(duì)Plusone2-Dclean-up試劑盒提純

7、前后的2-DPAGE圖譜進(jìn)行分析，我們可以看到兩者的蛋白表達(dá)圖譜大體相似，提純組條紋減少，背景清晰。結(jié)論通過Plusone2-Dclean-up試劑盒有效去除一些干擾物質(zhì)如去垢劑，鹽類、脂類等，可以減少一些干擾物質(zhì)對(duì)2-D圖譜的質(zhì)量的影響。 二、肝臟再生過程中蛋白表達(dá)差異的研究 目的本部分試驗(yàn)主要是研究肝臟再生過程中蛋白質(zhì)的表達(dá)差異，尋找影響肝臟再生的因子，進(jìn)一步了解肝臟再生的分子機(jī)制，為指導(dǎo)臨床肝病的診治提供依據(jù)。方法

8、試驗(yàn)分為8組：0h、2h、12h、24h、36h、48h、72h、1w共8個(gè)時(shí)間點(diǎn)。取大鼠部分肝切除術(shù)后8個(gè)時(shí)間點(diǎn)的殘余右肝組織各5例，大鼠均來(lái)源于第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體重在200-250g。通過組織裂解緩沖液來(lái)提取肝臟總蛋白，并進(jìn)行Plusone2-Dclean-up處理。使用Bradford法測(cè)定濃度，各自取300ug蛋白，經(jīng)過水化過夜，在相同條件下進(jìn)行雙向電泳，最后進(jìn)行快速銀染顯示蛋白點(diǎn)的分布。所得圖像借助圖像分析軟件Ima

9、gemaster2DElite進(jìn)行分析，選取顯著動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定，并借助互聯(lián)網(wǎng)上的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索程序Mascot，通過NCBInr蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索。選取有意義的蛋白點(diǎn)進(jìn)行Western-blotting證實(shí)。結(jié)果每塊膠中分別檢測(cè)到1200±20個(gè)蛋白點(diǎn)。我們發(fā)現(xiàn)78個(gè)有動(dòng)態(tài)變化的蛋白點(diǎn)，通過質(zhì)譜鑒定出38個(gè)有意義的蛋白。結(jié)論通過蛋白質(zhì)組的方法，我們對(duì)肝臟再生的差異蛋白進(jìn)行了比較，得到了一系列有意義的蛋白，

10、所鑒定的蛋白分別涉及到幾種不同的代謝途徑：氧化應(yīng)激反應(yīng)、急性期反應(yīng)蛋白、脂類代謝蛋白、能量代謝的酶類、參與信號(hào)傳導(dǎo)、參與蛋白代謝、神經(jīng)遞質(zhì)代謝、功能未知等。并對(duì)Prohibitin和Regucalcin兩種蛋白在肝臟再生中的作用進(jìn)行探討。 小結(jié)：本課題通過比較Plusone2-Dclean-up試劑盒處理前后的肝臟組織的雙向電泳圖譜，證實(shí)了Plusone2-Dclean-up試劑盒在不影響總蛋白量的情況下能夠有效的提純蛋白，減少