蛋白質(zhì)組學(xué)proteomics

1、蛋白質(zhì)組學(xué)Proteomics,張志超精細(xì)化工國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,Nature, 2006,439;168,蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展,1995年，蛋白質(zhì)組學(xué)的概念被提出，它在本質(zhì)上指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生，細(xì)胞代謝等過(guò)程的整體而全面的認(rèn)識(shí)。2001年，Nature，Science分別發(fā)表了” And now for the proteom

2、e” “Proteomics in genomeland”,雙向凝膠電泳,首先利用等電點(diǎn)聚焦來(lái)分離不同等電點(diǎn)的蛋白，再利用SDS－PAGE來(lái)分離不同分子量的蛋白，其分辨率是非常高的。微克級(jí)的蛋白質(zhì)就可以被很好的分辨開了。,基質(zhì)輔助的激光解吸電離技術(shù)（MALDI）的發(fā)展,日本島津公司的田中耕一的工作，是質(zhì)譜分析發(fā)展的一個(gè)主動(dòng)力。 1987年，在第二屆中－日質(zhì)譜分析聯(lián)合討論會(huì)上，田中耕一論述了軟激光解吸附技術(shù)可以使蛋白質(zhì)分子離子化。一年之后

3、，他的這篇?jiǎng)?chuàng)造性的論文發(fā)表在Rapid Communications in Mass Spectrometry上。田中耕一的工作為基質(zhì)輔助的激光解吸電離技術(shù)（Maldi）打下了基礎(chǔ)。2002年，他和弗吉尼亞聯(lián)邦大學(xué)的John B Fenn，由于他們對(duì)軟吸附電離方法上的貢獻(xiàn)一起被授予了該年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng),在Maldi發(fā)明之前，蛋白質(zhì)分子由于其較高的分子量實(shí)際上被排除在質(zhì)譜分析之外，而且使用傳統(tǒng)的技術(shù)也難以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行研究。 早期的激光解

4、吸附質(zhì)譜分析，將研究局限在相對(duì)分子量大約為5000～10000的范圍內(nèi)，這個(gè)限制就排除了對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)的研究，因?yàn)榇蠖鄶?shù)的蛋白質(zhì)分子在電離過(guò)程中容易散射而分解掉。Maldi使得對(duì)生物大分子的電離成為了可能。這是因?yàn)镸aldi可以使不具揮發(fā)性的生物樣品汽化、電離，直接進(jìn)入氣態(tài)。要分析的樣品和基質(zhì)——通常是丙三醇和鈷粉混合在一起。這種基質(zhì)可以吸收來(lái)自氮?dú)饧す獾?37nm 波長(zhǎng)的紫外激光并將其轉(zhuǎn)化為熱能，同時(shí)一小部分基質(zhì)包括最上表面的分析物

5、被迅速加熱，從樣品中氣化。由于基質(zhì)吸收了大多數(shù)的瞬時(shí)激光的能量，分子量高達(dá)1000000道爾頓的分子也能被成功地分解。,Madil 和Tof質(zhì)量分析器的聯(lián)用,Maldi大多數(shù)情況下是和Tof（飛行時(shí)間）質(zhì)量分析器聯(lián)用的。在Maldi－Tof裝置中，離子的形成、分離和檢測(cè)都是在高真空環(huán)境中完成的。當(dāng)從離子源加速之后，由于勢(shì)能的差別，就在飛行管中以不同的速度進(jìn)行飛行。離子的質(zhì)量越小，就以越快的速度穿過(guò)飛行管到達(dá)檢測(cè)器。因此，各不相同的離子質(zhì)

6、量，也就對(duì)應(yīng)了不同的飛行時(shí)間，這就是離子分離的原理。Maldi－Tof質(zhì)譜分析既可以用于生物大分子的質(zhì)量分析，例如低聚核苷酸、低聚糖、糖蛋白等；又可以用來(lái)生成附加的信息，例如從胰蛋白酶消化液中識(shí)別蛋白質(zhì)、監(jiān)測(cè)生物分子反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)、表征蛋白質(zhì)的結(jié)合和闡明蛋白質(zhì)更高級(jí)的結(jié)構(gòu)等。,ESI-MS的特點(diǎn),可以和液相色譜、毛細(xì)管電泳等現(xiàn)代化的分離手段聯(lián)用，從而大大擴(kuò)展了其在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍，包括藥物代謝、臨床和法醫(yī)學(xué)的應(yīng)用等 。相對(duì)于MAL

7、DI，對(duì)于蛋 白的檢測(cè)靈敏度更高，?？蛇_(dá)到飛克級(jí)水平以下。,串聯(lián)質(zhì)譜,通常, 樣本蛋白質(zhì)先由胰蛋白酶酶解成肽段, 形成多肽混合物。 此混合物送入多維高壓液相色譜儀及串聯(lián)質(zhì)譜儀, 在一級(jí)質(zhì)譜中進(jìn)行肽段離子化, 被選離子(母離子)經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離(collision induced dissociation, CID) 在二級(jí)質(zhì)譜中產(chǎn)生串聯(lián)質(zhì)譜。,應(yīng)用實(shí)例,1.通過(guò)比較給藥前后細(xì)胞的蛋白質(zhì)組,鑒別出毒理學(xué)的蛋白質(zhì)標(biāo)志物 。2. 瘧疾疫苗的研

8、究。,,,ICAT技術(shù),同位素標(biāo)記的親和標(biāo)簽（isotope-coded affinity tag，ICAT）技術(shù)作為一種體外標(biāo)記穩(wěn)定同位素的相對(duì)定量方法，已經(jīng)成為重要的蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析方案。1999年，Gygi等人用化學(xué)方法合成一種能和半胱氨酸反應(yīng)的親和試劑，稱為穩(wěn)定同位素編碼的親和標(biāo)簽，它有輕鏈和重鏈(穩(wěn)定重同位素)兩種形式，可以在體外標(biāo)記不同狀態(tài)下的蛋白質(zhì)樣品，酶解并用親和柱分離純化被標(biāo)記的肽段后，再用質(zhì)譜進(jìn)行分析，和體內(nèi)標(biāo)記法

9、一樣也能夠得到成對(duì)的峰表示不同樣品中肽段及對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)含量的差異。這種穩(wěn)定同位素親和標(biāo)簽技術(shù)可以廣泛地應(yīng)用在細(xì)胞和組織的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析上，提供精確的蛋白質(zhì)相對(duì)定量數(shù)據(jù)。,當(dāng)不同狀態(tài)的細(xì)胞被裂解后，分別加入不同標(biāo)記的ICAT與總蛋白質(zhì)反應(yīng)。ICAT的反應(yīng)基團(tuán)會(huì)專一與蛋白質(zhì)中的Cys共價(jià)結(jié)合，待充分反應(yīng)后，將二者等量混合，再用胰蛋白酶酶解，HPLC分離，就可對(duì)含生物素ICAT酶解片段進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析。,當(dāng)不同狀態(tài)的細(xì)胞被裂解后，分別加入不

10、同標(biāo)記的ICAT與總蛋白質(zhì)反應(yīng)。ICAT的反應(yīng)基團(tuán)會(huì)專一與蛋白質(zhì)中的Cys共價(jià)結(jié)合，待充分反應(yīng)后，將二者等量混合，再用胰蛋白酶酶解，HPLC分離，就可對(duì)含生物素ICAT酶解片段進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析。一對(duì)ICAT標(biāo)記來(lái)源不同細(xì)胞狀態(tài)下的相同肽段總是一前一后相鄰分布在質(zhì)譜圖上，且分子量正好相差8。通過(guò)MS／MS鑒定出該片段屬于何種蛋白質(zhì)后，計(jì)算二者峰值的差異，就可知這種蛋白質(zhì)在二種細(xì)胞狀態(tài)下表達(dá)的情況。,ICAT的優(yōu)點(diǎn),ICAT具有廣泛的兼容性

11、，主要表現(xiàn)在：(1)能夠兼容分析任何條件下體液、細(xì)胞、組織中絕大部分蛋白質(zhì)；(2)烷化反應(yīng)即使在鹽、去垢劑、穩(wěn)定劑(如SDS、尿素、鹽酸胍等)存在下都可進(jìn)行；(3)只需分析含Cys殘基的肽段，從而降低了蛋白質(zhì)混合物分析的復(fù)雜性；(4)ICAT戰(zhàn)略允許任何類型的生化、免疫、物理的分離方法，因此能很好地定量分析微量蛋白質(zhì)。,基于整體蛋白的質(zhì)譜差異分析,表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜( surface-enhanced laserdeso

12、rptionPionization time of flightmass spectrometry , SELDITOF/MS)法由Ciphergen公司推出,將蛋白質(zhì)芯片技術(shù)與質(zhì)譜聯(lián)用,通過(guò)質(zhì)譜峰度直接反映樣品中的蛋白差異。可使用不同化學(xué)表面(疏水、親水、陽(yáng)離子、陰離子、金屬離子螯合)和生物表面(抗原-抗體、受體-配體、DNA-蛋白質(zhì))的芯片,與樣品混合,與芯片表面結(jié)合的整體蛋白被TOF/MS解離出來(lái),從一級(jí)質(zhì)譜圖上可得到蛋