人胰液差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的：優(yōu)化用于人胰液蛋白質(zhì)組研究的雙向電泳方法，篩選胰液腫瘤標(biāo)志物的侯選以及可能與發(fā)病機(jī)制相關(guān)的蛋白質(zhì)。 方法：比較多種因素對雙向電泳圖譜質(zhì)量的影響。優(yōu)化的雙向電泳及圖像分析方法選取差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)，經(jīng)質(zhì)譜分析等鑒定。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)方法檢測胰腺癌相關(guān)蛋白質(zhì)在胰腺癌組織的基因表達(dá)。結(jié)果：1.獲得了重復(fù)性好、分辨率高的胰液雙向電泳圖譜。2.鑒定了在胰腺癌或慢性胰腺炎患者胰液標(biāo)本特異表達(dá)的7個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。3.在胰腺癌患者胰液中鑒定

2、的特異表達(dá)蛋白質(zhì)可以在組織中獲得基因表達(dá)水平的驗(yàn)證。結(jié)論：雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜鑒定是胰液差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究的可靠平臺(tái)。胰腺癌患者胰液中特異表達(dá)的蛋白質(zhì)PSTI和TTR可能是胰液腫瘤標(biāo)志物的侯選，本研究提示了慢性炎癥與腫瘤發(fā)生機(jī)制可能聯(lián)系的相關(guān)依據(jù) 早期診斷和有效治療的基礎(chǔ)是發(fā)現(xiàn)能夠監(jiān)測疾病發(fā)生發(fā)展過程的理想的生物學(xué)標(biāo)志。隨著人類基因組計(jì)劃的初步完成，基因水平的研究已經(jīng)揭示了眾多被認(rèn)為在胰腺疾病發(fā)生發(fā)展過程中起作用的改變；功能基因組學(xué)

3、研究發(fā)現(xiàn)了一批與此相關(guān)的基因表達(dá)水平的異常。目前認(rèn)為胰腺導(dǎo)管腺癌等疾病都存在多階段發(fā)展過程，并伴隨多種特異的基因突變累積。但是這些研究無法完整地揭示胰腺疾病的本質(zhì)。作為生命活動(dòng)的體現(xiàn)者和執(zhí)行者，蛋白質(zhì)水平的研究不僅可以更為完整地認(rèn)識(shí)疾病過程，并且蛋白質(zhì)也可能成為一類最為理想的腫瘤標(biāo)志物，而目前這方面研究還相對較少。蛋白質(zhì)組學(xué)的概念是由基因組編碼的全部蛋白質(zhì)。目前研究著重于篩選不同病理狀態(tài)下蛋白質(zhì)組中特異標(biāo)志與關(guān)鍵蛋白質(zhì)的研究，即所謂差異

4、蛋白質(zhì)組學(xué)研究。當(dāng)今蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)以質(zhì)譜(MS)分析為核心獲取對蛋白質(zhì)的精確鑒定，作為分析基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)分離技術(shù)仍然以雙向電泳(2-DE)為主導(dǎo)。 胰腺疾病的蛋白質(zhì)組學(xué)研究近年已經(jīng)開展，初步揭示了不同的病理生理?xiàng)l件下胰腺組織蛋白質(zhì)譜的變化。而作為公認(rèn)的極有意義的研究對象，胰液蛋白質(zhì)組研究進(jìn)展卻相對滯后。胰液具有高度的組織專一性，蛋白質(zhì)含量豐富，不但可以體現(xiàn)胰腺外分泌功能，還包含了疾病狀態(tài)下病變組織及其微環(huán)境排泌的特異性蛋白質(zhì)，并且

5、胰液蛋白質(zhì)譜的改變可以反映不同病理狀態(tài)及其動(dòng)態(tài)發(fā)展過程的變化，癌前病變病人胰液的蛋白質(zhì)組研究對于早期診斷意義尤其重要，臨床檢驗(yàn)也要求能夠從胰液這樣的體液標(biāo)本獲得可靠的鑒別。胰液蛋白質(zhì)組研究不是針對單一的特異性生物學(xué)標(biāo)志，而是全面比較所有的差異蛋白質(zhì)，綜合的結(jié)果有可能發(fā)現(xiàn)以往檢測單個(gè)蛋白質(zhì)水平變化所無法承擔(dān)的決定性診斷策略。 本研究試圖通過對胰腺癌、慢性胰腺炎和單純膽總管結(jié)石患者胰液的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究，應(yīng)用2-DE、MS以及生物

6、信息學(xué)方法分析胰腺癌和慢性胰腺炎相關(guān)特異蛋白質(zhì)，篩選胰腺癌患者胰液中可能的蛋白質(zhì)類腫瘤標(biāo)志物，胰腺癌和慢性胰腺炎發(fā)病機(jī)制可能相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)異常，并對蛋白質(zhì)組學(xué)研究的結(jié)果作相應(yīng)的驗(yàn)證。 第一部分人胰液蛋白質(zhì)組的雙向電泳 胰液作為公認(rèn)的重要研究對象，對其在不同病理生理狀態(tài)下的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究有助于腫瘤標(biāo)志物的篩選和發(fā)病機(jī)制的闡明。當(dāng)今基于蛋白質(zhì)分離技術(shù)分析蛋白質(zhì)差異表達(dá)的核心手段仍然是雙向電泳(two-dimension

7、algelelectrophoresis,2-DE)，目前人胰液蛋白質(zhì)組相關(guān)研究較少，缺乏不同病理狀態(tài)下胰液蛋白質(zhì)組的差異比較，而精確的比較需要重復(fù)性和分辨率良好的胰液2-DE作保障，所以本研究首先比較胰液2-DE的多種影響因素，以期建立優(yōu)化的胰液2-DE方法，為進(jìn)一步選取差異表達(dá)蛋白質(zhì)及其分析建立基礎(chǔ)。 目的：建立優(yōu)化的用于胰液差異蛋白質(zhì)組研究的雙向電泳方法。方法：經(jīng)內(nèi)鏡逆行胰膽管造影(ERCP)術(shù)中抽取或留置鼻胰管收集純胰液

8、標(biāo)本5例，2例為胰腺癌患者胰液標(biāo)本，其手術(shù)病理分別為胰腺中分化導(dǎo)管腺癌及導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤癌變；2例為慢性胰腺炎患者胰液標(biāo)本；1例為單純膽總管結(jié)石患者的胰液標(biāo)本。分別進(jìn)行多次雙向電泳，比較不同的標(biāo)本保存時(shí)間、制備方法、泡脹液組成、固相pH膠條、等電聚焦條件及染色方案等因素對雙向電泳圖譜質(zhì)量的影響。結(jié)果：1.經(jīng)ERCP及留置鼻胰管均成功收集到胰液標(biāo)本，胰液量約為1.5ml-50ml，Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度為0.2-4.4μg/μl。

9、2.胰液標(biāo)本在-80℃保存4個(gè)月對于2-DE圖譜沒有明顯影響。3.根據(jù)圖譜質(zhì)量比較認(rèn)為：三氯乙酸/丙酮沉淀后再以泡脹液C(7M尿素，2M硫脲,2％CHAPS，65mMDTT，0.5％IPG緩沖液)復(fù)溶是優(yōu)化的標(biāo)本制備方法，80μg上樣量可以在銀染的分析凝膠(pH3-10，13cmIPG膠條)上見到約80-90個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，重復(fù)性和分辨率都優(yōu)于將胰液直接和泡脹液混合上樣；而考染即使上樣量達(dá)到1000μg也只能見到約30個(gè)點(diǎn)；應(yīng)用窄范圍IPG

10、膠條(pH4-7,13cm)，140μg上樣量可以在銀染的分析凝膠上見到約120個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，將上樣量提高到260μg，并采用兼容MS的銀染方案所獲得的圖譜同樣具有良好的重復(fù)性和分辨率。4.不同病理狀態(tài)的胰液標(biāo)本都可應(yīng)用本研究優(yōu)化的2-DE方法獲得穩(wěn)定的圖譜，它們均表現(xiàn)出一定程度的相似性。結(jié)論：標(biāo)本制備是胰液雙向電泳的關(guān)鍵，三氯乙酸/丙酮沉淀繼以含硫脲的泡脹液復(fù)溶是合理的標(biāo)本制備方法；應(yīng)用窄范圍固相pH膠條可以在增加標(biāo)本上樣量的同時(shí)改善分

11、辨率。優(yōu)化的方法可以獲得重復(fù)性好、分辨率高的雙向電泳圖譜，為胰液差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。 第二部分胰腺癌和慢性胰腺炎患者胰液差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究 胰腺癌的早期診斷尤其是早期胰腺癌與慢性胰腺炎的鑒別診斷非常困難。差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究的目的是發(fā)現(xiàn)監(jiān)測胰腺疾病發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)標(biāo)志，根據(jù)病理生理狀態(tài)下特異表達(dá)的蛋白質(zhì)推斷和闡明疾病的發(fā)病機(jī)制，本研究應(yīng)用前一部分所建立的胰液2-DE方法，比較選取胰腺癌和慢性胰腺炎特異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)

12、，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-MS/MS)結(jié)合生物信息學(xué)方法鑒定。 目的：發(fā)現(xiàn)胰腺癌和慢性胰腺炎患者胰液中特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)，篩選腫瘤標(biāo)志物的侯選以及可能與發(fā)病機(jī)制相關(guān)的蛋白質(zhì)。方法：人胰液標(biāo)本10例，4例為胰腺癌患者胰液標(biāo)本，其中2例手術(shù)病理分別為胰腺中分化導(dǎo)管腺癌及導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤癌變，另外2例經(jīng)影像檢查結(jié)合臨床診斷；4例為慢性胰腺炎患者胰液標(biāo)本；2例為單純膽總管結(jié)石患者的胰液標(biāo)本。按第一部分方法2-DE，應(yīng)

13、用兼容MS銀染，圖像分析選取差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，切取后MALDI-MS/MS并檢索數(shù)據(jù)庫鑒定。結(jié)果：1.經(jīng)ERCP及留置鼻胰管均成功收集到胰液標(biāo)本，胰液量約為1.5ml-80ml，Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度為0.2-8.9μg/μl。2.胰腺癌、慢性胰腺炎和單純膽總管結(jié)石等不同病理狀態(tài)的胰液標(biāo)本都可應(yīng)用第一部分研究優(yōu)化的2-DE方法獲得穩(wěn)定的圖譜，它們均表現(xiàn)出很大程度的相似性，多數(shù)蛋白質(zhì)點(diǎn)分布于pH4-7區(qū)域。80μg-120μg

14、上樣量，pH3-10，13cm的IPG膠條所獲得的2-DE圖譜分辨率較低，胰腺癌和慢性胰腺炎的參考膠重復(fù)性和分辨率不足以進(jìn)行差異比較；而120μg-140μg上樣量，pH4-7，13cmIPG膠條所獲得的2-DE圖譜分辨率較高，可以用于差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的比較選取，約260μg上樣量可以制備兼容MS的銀染微量制備膠，與銀染的分析膠相比其重復(fù)性良好。3.經(jīng)過圖像分析比較選取差異明顯的蛋白質(zhì)點(diǎn)，切取僅見于胰腺癌患者胰液標(biāo)本的蛋白質(zhì)點(diǎn)5個(gè)，僅見于慢

15、性胰腺炎患者胰液標(biāo)本的蛋白質(zhì)點(diǎn)2個(gè)，MALDI-MS/MS鑒定，全部成功獲得可信結(jié)果；在胰腺癌患者胰液標(biāo)本特異表達(dá)的5個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)鑒定結(jié)果分別為ChainA,HumanSerumAlbuminMutantR218p；HumanSerumAlbumininAComplexWithMyristicAcidAndTri-IodobenzoicAcid；pancreaticlipase；pancreaticsecretorytrypsininhi

16、bitor；ChainB,Transthyretin-V1221CARDIOMYOPATHICMUTANT。在慢性胰腺炎患者胰液標(biāo)本特異表達(dá)的2個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)鑒定結(jié)果分別為hypotheticalprotein；alloalbuminVenezia。結(jié)論：2-DE結(jié)合MS是差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究的可靠方法，胰腺癌患者胰液中特異表達(dá)的蛋白質(zhì)PSTI和TTR可能是腫瘤標(biāo)志物的侯選，提示了慢性炎癥與腫瘤發(fā)生機(jī)制可能聯(lián)系的相關(guān)依據(jù)。 第三部分胰

17、腺癌相關(guān)蛋白質(zhì)的驗(yàn)證 目的：在基因表達(dá)(mRNA)水平驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)研究的結(jié)果。方法：20例胰腺癌組織均來自長海醫(yī)院手術(shù)切除的組織標(biāo)本，抽提總RNA，兩步法反轉(zhuǎn)為cDNA，應(yīng)用生物軟件primerpremier5設(shè)計(jì)引物，RT-PCR方法檢測PSTI、TTR、KIAA1018在胰腺癌組織的mRNA表達(dá)。結(jié)果：PSTI、TTR在胰腺癌組織中mRNA表達(dá)的陽性率分別為90％(18/20)和60％(12/20)，KIAA1018在胰腺