電刺激處理牛肉的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、嫩度是衡量牛肉食用品質(zhì)好壞的重要指標(biāo)。我國(guó)的牛肉要想進(jìn)入世界牛肉主流市場(chǎng)，改變依賴進(jìn)口優(yōu)質(zhì)牛肉的被動(dòng)局面，應(yīng)該將提高牛肉嫩度作為推動(dòng)牛肉產(chǎn)業(yè)良性發(fā)展的核心任務(wù)。牛肉的嫩度除了受肉牛年齡和品種等生理方面的影響外，還受宰后處理方式的影響。電刺激處理對(duì)宰后成熟過(guò)程中牛肉蛋白質(zhì)的影響仍是在肉品界的研究熱點(diǎn)。電刺激確實(shí)提高了宰后肌肉蛋白質(zhì)的降解速度，但導(dǎo)致其降解的作用機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，還需要進(jìn)一步研究。近年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)成為研究蛋白質(zhì)的熱門方法，

2、尤其是差異蛋白質(zhì)組學(xué)，通過(guò)尋找、篩選和鑒定與肉品質(zhì)性狀有相關(guān)性的標(biāo)記蛋白，全面和深入洞察肉品品質(zhì)的形成機(jī)理，為進(jìn)一步解釋肉品間品質(zhì)差異的根源提供了科學(xué)依據(jù)。因此，運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法來(lái)評(píng)估肉品品質(zhì)具有十分重要的意義。
　　本研究首先測(cè)定了牛肉品質(zhì)指標(biāo)，優(yōu)化差異蛋白質(zhì)組學(xué)的雙向電泳條件，建立了牛背最長(zhǎng)肌雙向電泳凝膠體系后，利用這個(gè)體系研究了電刺激后牛背最長(zhǎng)肌中差異蛋白質(zhì)，分析鑒定這些蛋白質(zhì)在電刺激影響牛肉嫩度中的作用機(jī)制，探討機(jī)理。

3、
　　主要結(jié)果如下:
　　一、電刺激后牛背最長(zhǎng)肌食用品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定
　　選擇了20頭中國(guó)黃牛（延邊?！廖鏖T塔爾牛），每組10頭，分成兩組。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工藝屠宰后，一組樣品電刺激，另一組樣品作為對(duì)照。分別測(cè)定了宰后2h、6h、24h、72h牛背最長(zhǎng)肌的溫度、pH值及宰后1d、3d的剪切力值。
　　結(jié)果表明，電刺激提高了宰后早期的胴體溫度，使pH值快速降低，降低了宰后1d、3d時(shí)的剪切力值，提高了嫩度。
　　二、建立

4、牛背最長(zhǎng)肌雙向電泳技術(shù)體系
　　對(duì)牛背最長(zhǎng)肌總蛋白的提取方法，包括:裂解液，上樣量，膠條pH范圍，蛋白質(zhì)定量，染色，樣品處理，聚焦條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了適合牛背最長(zhǎng)肌總蛋白提取的方法及雙向電泳技術(shù)體系。
　　結(jié)果顯示，提取總蛋白時(shí)，選取裂解液中DTT濃度為60mmol/L,直接裂解法提取的蛋白點(diǎn)數(shù)量最多且分離效果最好，蛋白質(zhì)提取后使用雙向電泳配套定量試劑盒進(jìn)行精確定量。由于需要研究的蛋白質(zhì)范圍越廣且越清晰越好，雙向電泳條件選擇

5、上樣量為400μg，24cm，pH3-10非線性膠條進(jìn)行。等電聚焦條件為:50v水化12h，100v2h，200v1h，500v30min，1000v20min，3000v20min，5000v15000vhr，使用考馬斯亮藍(lán)染色，簡(jiǎn)便快速，得到的蛋白點(diǎn)易于處理并進(jìn)行下一步分析。
　　三、電刺激后牛背最長(zhǎng)肌蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　利用PDQuest軟件分析宰后1d和3d時(shí)電刺激處理牛背最長(zhǎng)肌中有顯著降解的差異蛋白點(diǎn)，包括凝膠圖譜

6、比對(duì)、雙向電泳分離的重復(fù)性及其效果、差異蛋白點(diǎn)凝膠放大及3D圖比對(duì)，然后對(duì)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定分析、Real-timePCR及Westernblot鑒定分析。
　　結(jié)果顯示，與未電刺激樣品相比，在宰后1d和3d電刺激處理牛背最長(zhǎng)肌中有12個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)明顯下調(diào)，分為9種蛋白質(zhì):肌間線蛋白(Desmin)、肌鈣蛋白-T(TroponinTalphaisoform)、肌球蛋白結(jié)合蛋白H(MyosinbindingproteinH);肌

7、酸激酶(Creatinekinase，2個(gè))、磷酸丙糖異構(gòu)酶(Triosephosphateisomerase，2個(gè));過(guò)氧化物氧化還原酶（Peroxiredoxin-6，2個(gè)）、磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(Phosphatidylethanolamine-bindingprotein);組蛋白(HistoneH3.3-likeisoform2)、甲基轉(zhuǎn)移酶(Methyltransferase)。
　　四、電刺激后差異蛋白質(zhì)影響嫩度的作

8、用機(jī)制
　　分析表明，電刺激后9種蛋白質(zhì)通過(guò)四條途徑影響電刺激后嫩度變化，具體機(jī)制如下:
　　1.電刺激通過(guò)糖酵解代謝途徑影響嫩度
　　電刺激后代謝酶Creatinekinase和Triosephosphateisomerase表達(dá)下調(diào)，表明電刺激加快糖酵解途徑，Creatinekinase和Triosephosphateisomerase快速消耗，pH值快速下降。
　　2.電刺激通過(guò)鈣激活中性蛋白酶途徑影響嫩度

9、
　　電刺激后骨架蛋白Desmin、TroponinTalphaisoform、MyosinbindingproteinH表達(dá)下調(diào)，表明電刺激激活Calpains蛋白酶體系，加速降解骨架蛋白Desmin、TroponinTalphaisoform、MyosinbindingproteinH，剪切力降低，嫩度提高。
　　3.電刺激通過(guò)溶酶體途徑影響嫩度
　　電刺激后Peroxiredoxin-6表達(dá)下調(diào)，表明電刺激后pH

10、不斷下降，直到極限pH為5.4左右，肌漿中Ca2+濃度升高，Peroxiredoxin-6主要發(fā)揮Ca2+依賴的磷脂酶A2活性，導(dǎo)致溶酶體膜破裂，溶酶體內(nèi)的水解酶釋放，使肌肉蛋白水解，嫩度提高。
　　4.電刺激通過(guò)氧化應(yīng)激途徑影響嫩度
　　電刺激影響嫩度的有關(guān)氧化應(yīng)激途徑主要有MAPK級(jí)聯(lián)途徑和PI3K/Akt信號(hào)通路。
　　(1)Peroxiredoxin-6在p38MAPK級(jí)聯(lián)途徑中的作用機(jī)制
　　Perox

11、iredoxin-6在pH接近中性時(shí)，發(fā)揮過(guò)氧化物氧化還原酶活性，通過(guò)p38MAPK級(jí)聯(lián)途徑刺激增殖和抑制細(xì)胞凋亡，pH為5.0左右時(shí)發(fā)揮溶酶體中的磷脂酶A2活性。電刺激后Peroxiredoxin-6表達(dá)下調(diào)，pH不斷下降，直到極限pH為5.4左右，肌漿中Ca2+濃度升高，表明Peroxiredoxin-6主要發(fā)揮Ca2+依賴的磷脂酶A2活性，通過(guò)溶酶體途徑使肌肉蛋白水解，在一定程度上抑制了p38MAPK級(jí)聯(lián)途徑，抑制增殖，加速氧化凋

12、亡，嫩度提高。
　　(2)PEBP在Ras-MAPK級(jí)聯(lián)途徑中的作用機(jī)制
　　電刺激后磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(PEBP)表達(dá)下調(diào)。牛屠宰后胴體內(nèi)產(chǎn)生活性氧，激活Ras-MAPK級(jí)聯(lián)途徑，PEBP與Raf-1相互起作用，抑制Ras-MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑。電刺激后PEBP表達(dá)下調(diào)，表明電刺激加速PEBP抑制Ras-MAPK級(jí)聯(lián)途徑，抑制增殖，加速氧化凋亡，嫩度提高。
　　(3)MT在PI3K/Akt信號(hào)通路中的作用機(jī)制

13、>　　PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖，避免細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且能夠激活甲基轉(zhuǎn)移酶(MT)。而MT表達(dá)越低，甲基化水平越低，凋亡越快。電刺激后組蛋白和甲基轉(zhuǎn)移酶下調(diào)，表明甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)降低，組蛋白甲基化水平降低，加速凋亡，在一定程度上抑制了PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制增殖，加速氧化凋亡，嫩度提高。
　　電刺激通過(guò)氧化應(yīng)激途徑影響嫩度的信號(hào)通路表明，牛肉嫩化與氧化、凋亡有密切聯(lián)系;電刺激在一定程度上抑制增殖，加速氧化和