CUL4B差異蛋白質(zhì)組學(xué)初步研究.pdf

1、2007年，本實驗室鄒永新等定位了一個X連鎖精神發(fā)育遲滯致病基因CUL4B，隨后對該基因的表達模式及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控、亞細胞定位和在細胞增殖中的作用進行了分析。CUL4B屬于 Cullin基因家族，該家族成員是泛素連接酶E3(ubiquitin ligase enzymes)的重要組成部分，在蛋白的泛素化過程中發(fā)揮重要的功能。由于對 CUL4B基因發(fā)揮功能的作用機制知之甚少，本研究采用差異蛋白質(zhì)組學(xué)的方法分析該基因表達產(chǎn)物CUL4B引起的蛋白

2、表達譜的變化，進而探索其在相關(guān)生物過程中的可能作用機制。
　　 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)由于其高通量、高靈敏度、高精度的特點在生命科學(xué)研究領(lǐng)域中受到了越來越多的青睞。在常規(guī)技術(shù)的基礎(chǔ)上，本研究對以二維電泳-質(zhì)譜(Two-dimensional electrophoresis-Mass Spectrometer,2 DE-MS)聯(lián)用的蛋白質(zhì)組學(xué)部分流程進行了改進，包括樣品的制備，凝膠染色相應(yīng)的膠內(nèi)酶解等。在此基礎(chǔ)上，通過利用 CUL4B穩(wěn)定

3、低表達及過表達HEK293體系，進行 CUL4B差異蛋白質(zhì)組學(xué)初步研究。
　　 第一部分二維電泳-質(zhì)譜聯(lián)用蛋白質(zhì)組學(xué)部分流程優(yōu)化
　　 首先，本研究對二維電泳-質(zhì)譜聯(lián)用蛋白質(zhì)組學(xué)部分流程進行了優(yōu)化，主要包括樣品制備的優(yōu)化和膠內(nèi)酶解的改進。在這一環(huán)節(jié)中，探索的條件主要包括：洗滌液的選擇，裂解緩沖液配方以及蛋白樣品的純化。本課題從以下幾方面進行了比較：在PCl2（大鼠嗜鉻細胞瘤細胞系）可溶性總蛋白二維電泳流程中，低離子強度的

4、緩沖液250mM山梨醇/lOmM Tris-base(pH7.0-7.4)和常用的樣品清洗緩沖液 PBS分別洗滌收集樣品；裂解緩沖液中 EDTA和 Tris-base的添加與否；硫脲的有無以及 DTT的濃度；蛋白樣品的純化與否以及純化的方法，分別比較了不純化、TCA-丙酮沉淀法和2-D cleanup kit(Bio-Rad)處理的差異。結(jié)果表明，250mM山梨醇/10mM Tris-base與 PBS相比，顯著地降低了樣品的鹽離子濃度

5、，使電壓可順利地上升至最大設(shè)定值，保證等電聚焦的充分進行；EDTA和Tris-base的添加與否對二維電泳結(jié)果沒有顯著影響；樣品經(jīng)2M硫脲和7M尿素組合處理后的二維電泳表現(xiàn)優(yōu)于9M尿素；DTT濃度為65mM時點在膠圖上的表現(xiàn)優(yōu)于操作手冊推薦的10mM:經(jīng)2-D cleanup kit(Bio-Rad)處理樣品的二維電泳表現(xiàn)優(yōu)于另外兩種，但是此法與未純化組相比會導(dǎo)致部分蛋白信息在膠圖上的丟失。
　　 在優(yōu)化二維電泳條件的同時，本研

6、究完善了一種高效的適用于銀染和考染蛋白質(zhì)凝膠的膠內(nèi)酶解方法。在這一環(huán)節(jié)中，通過用一維 SDS-PAGE分別分離總量為30ng、50ng和100ng的BSA(Bovine Serum Albumin)，采用銀染顯色；一維SDS-PAGE分別分離總量為lμg、3μg、5μg和10μg的BSA，考染顯色。從得到的一維凝膠上，選取若干目標蛋白條帶分別采用目前廣泛使用的AndrejShevchenko等(2007)提出的膠內(nèi)酶解方法（以下簡稱為A

7、法）和改進的膠內(nèi)酶解方法（以下簡稱為B法）處理，用基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF MS)分析，再通過 Mascot軟件查詢 NCBIbovine數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì)。這一部分結(jié)果表明 B法在匹配的肽段數(shù)、序列覆蓋率和蛋白得分值等方面都顯著高于 A法。將 B法應(yīng)用于酶解PC12可溶性總蛋白，經(jīng)二維電泳分離后凝膠上的點，同樣獲得了較好的蛋白鑒定結(jié)果。
　　 第二部 HEK293體系中 CUL4B差異蛋白質(zhì)組學(xué)研

8、究
　　 通過二維電泳分別分離野生型 HEK293和實驗室已建立的利用 RNAi技術(shù)干擾 CUL4B基因表達的miRNA-CUL4B-HEK293及其對照細胞系miNeg-HEK293可溶性總蛋白，銀染顯色，PDQuest2-D軟件分析找出差異蛋白。將這些差異點采用 B法酶解，用基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF MS/MS）分析，再通過Mascot軟件查詢 NCBI-Human數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì)。這一部分取

9、得研究結(jié)果：共鑒定了33個差異蛋白，其中蛋白得分值位于95％可信區(qū)間的共有21個。
　　 同時，構(gòu)建 CUL4B穩(wěn)定過表達細胞系 pcDNA3.1A-CUL4B-HEK293及其對照細胞系 pcDNA3.1A-HEK293，分別通過二維電泳分離其可溶性總蛋白，銀染顯色，PDQuest2-D軟件分析找出差異蛋白。酶解后，用基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF MS)分析，再通過 Mascot軟件查詢 NCBIH

10、uman數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì)。這一部分取得研究結(jié)果：共鑒定了15個差異蛋白，其中蛋白得分值位子95％可信區(qū)間的共有9個。對 CUL4B穩(wěn)定低表達及過表達體系篩選出的一些重要蛋白做了Westem blotting和免疫共沉淀等檢測驗證。
　　 綜上所述，本研究優(yōu)化了適用 PC12和 HEK293的二維電泳-質(zhì)譜聯(lián)用蛋白質(zhì)組學(xué)流程；在此基礎(chǔ)上，進一步探討了在 HEK293中 CUL4B基因低表達和過表達分別可能引起的蛋白質(zhì)組變化。這些研