棗樹雄性不育的蛋白質(zhì)組學(xué)初步研究.pdf

1、棗(Ziziphus jujuba Mill.)是我國(guó)的特色優(yōu)勢(shì)果樹和第一大干果樹種。優(yōu)良品種是優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、高效栽培的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。然而，現(xiàn)有的棗樹優(yōu)良品種大多存在這樣或那樣的嚴(yán)重缺陷。棗樹生產(chǎn)上迫切需要通過(guò)雜交育種將不同品種的優(yōu)良特性整合在一起，培育出綜合性狀優(yōu)良的新品種。但迄今為止，真正意義上的棗樹雜交育種尚未開(kāi)展起來(lái)，主要原因是棗樹去雄難，棗花小且雄先熟，大多在裂蕾之前成熟，普遍存在閉花授粉，這就要求人工去雄必須在裂蕾以前，而花蕾直

2、徑只有3mm左右，在裂蕾前進(jìn)行去雄操作非常困難，極易傷害花器官，導(dǎo)致人工受粉成功率極低。在雜交中應(yīng)用雄性不育種質(zhì)，可以省去人工去雄環(huán)節(jié)，有利于成功實(shí)現(xiàn)雜交授粉。棗樹雄性不育研究是解決棗樹人工去雄難題、推進(jìn)棗樹雜交育種的關(guān)鍵和根本性途徑之一。如果能應(yīng)用雄性不育材料，揭示棗樹雄性不育的機(jī)理，探索出人工高效誘導(dǎo)雄性不育的措施，則可以免去人工去雄環(huán)節(jié)，從根本上解決人工去雄的難題，大大加快棗樹的雜交育種工作，進(jìn)而解決棗產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展與棗樹育種工作滯

3、后之間的矛盾；此外對(duì)于棗樹雄性不育機(jī)理研究，還可以為認(rèn)識(shí)花粉發(fā)育、細(xì)胞質(zhì)遺傳以及核質(zhì)互作提供重要參考。 本研究首先以棗樹葉片、花蕾及韌皮部組織為材料，通過(guò)優(yōu)化條件成功建立了棗樹的蛋白質(zhì)雙向電泳體系。進(jìn)而采用此改進(jìn)的方法對(duì)課題組發(fā)現(xiàn)的棗樹雄性不育1號(hào)、3號(hào)以及雄性可育材料淶水鈴棗和金絲小棗花蕾發(fā)育的不同階段的蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳分析，發(fā)現(xiàn)了棗樹雄性敗育過(guò)程中特異表達(dá)的蛋白，為接下來(lái)研究棗樹雄性不育過(guò)程中的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。其

4、主要研究結(jié)果如下： 1.建立了兩種適合棗不同組織的蛋白質(zhì)提取方法?？扇苄缘鞍踪|(zhì)提取法對(duì)葉片及韌皮部的蛋白提取量(分別為1.89mg/g和1.11mg/g)略高于全蛋白提取法(分別為1.80mg/和1.04mg/g)，而全蛋白提取法對(duì)花蕾的蛋白提取量(8.75mg/g)略高于可溶性蛋白提取法(7.68mg/g)。 2.對(duì)雙向電泳中的重要步驟進(jìn)行了優(yōu)化，建立了一種適合棗的雙向電泳技術(shù)體系：最佳蛋白上樣量50μL(約220ug

5、)；2.5％的兩性電解質(zhì)且pH3.5～9：pH4～6：pH6～9=1：1：3的配比更適合育木本植物；最佳平衡時(shí)間為30min至1h；第二向SDS-PAGE電泳的最佳電泳值為135V；改進(jìn)了等電聚焦(IEF)的膠條灌制方法，將傳統(tǒng)的“垂直灌膠”法改為“平放灌膠”法，大大降低了操作難度系數(shù)；IEF膠條灌制之前向膠管中注入少量疏水劑--4％Repe1，有利于第一向電泳后的取膠；取消了傳統(tǒng)的第一向電泳的預(yù)聚焦，適當(dāng)延長(zhǎng)正式聚焦時(shí)間(達(dá)到1000

6、0V-h)可以取得更佳電泳效果。 3.經(jīng)優(yōu)化后的棗雙向電泳技術(shù)體系可以用于棗不同組織的蛋白質(zhì)分析。棗葉片、花蕾、韌皮部的全蛋白質(zhì)經(jīng)雙向電泳分離，經(jīng)銀染色后均可得到穩(wěn)定性和重復(fù)性好、分辨率較高的雙向電泳圖譜。 4.棗雄性可育和不育品種花蕾發(fā)育過(guò)程中的蛋白表達(dá)趨勢(shì)不同。從小蕾期到中蕾期再到黃蕾期，雄性可育材料蛋白質(zhì)表達(dá)表現(xiàn)出高--低--高的變化趨勢(shì)；雄性不育1號(hào)(JMS1)蛋白質(zhì)表達(dá)表現(xiàn)出高--低--低的變化趨勢(shì)；雄性不育3

7、號(hào)(JMS3)蛋白質(zhì)表達(dá)表現(xiàn)出低--高--低的變化趨勢(shì)。 5.棗樹雄性不育可能與一些差異表達(dá)蛋白質(zhì)相關(guān)。在敗育期間，JMS1有6個(gè)明顯的特異表達(dá)蛋白點(diǎn)及28個(gè)表達(dá)受阻的蛋白點(diǎn)，其中6個(gè)明顯特異表達(dá)的蛋白點(diǎn)全部分布在pH8.0～pH8.2的堿性端區(qū)域內(nèi)(100％)，28個(gè)表達(dá)受阻的蛋白點(diǎn)中個(gè)有6個(gè)點(diǎn)分布在pH4.0～pH5.0的酸性端區(qū)域內(nèi)(21.4％)、18個(gè)點(diǎn)分布在pH5.0～pH7.0的偏酸性端區(qū)域內(nèi)(64.3％)、4個(gè)點(diǎn)分布在pH