犏牛雄性不育相關(guān)蛋白篩選研究.pdf

1、犏牛的雄性不育是由于精子發(fā)生阻滯造成的，由此導致牦牛育種中無法對犏牛雜合優(yōu)秀基因的有效利用，在研究犏牛精子發(fā)生阻滯機制機理方面，雖然前人已經(jīng)做了一些工作，但是犏牛和牦牛之間睪丸蛋白質(zhì)比較組學的研究尚未報道，因此在睪丸蛋白組學水平篩選可能導致犏牛精子發(fā)生阻滯的重要蛋白并深入研究其功能具有重要的生殖生物學基礎(chǔ)理論意義。本研究應(yīng)用iTRAQ方法對牦牛和犏牛睪丸蛋白組進行比較研究，鑒定出了256個顯著差異表達蛋白，其中大量上調(diào)蛋白可能參與多種應(yīng)

2、激反應(yīng)（特別是炎癥性應(yīng)激）、增強生精細胞間黏附性或抑制生精細胞向曲細精管官腔的遷移，而許多下調(diào)蛋白主要與精子發(fā)生中多種細胞代謝缺陷和細胞分化過程有關(guān)，這項研究發(fā)現(xiàn)的很多重要蛋白可能與犏牛精子發(fā)生阻滯相關(guān)，這些蛋白將對犏牛精子發(fā)生阻滯分子機制的深入研究提供重要信息和切入點。
　　主要研究結(jié)果如下：
　　1.從犏牛和牦牛睪丸組織切片可以看出，犏牛睪丸曲細精管外膜萎縮且不規(guī)整，可能是由細胞凋亡引起的。在牦牛曲細精管中，從基底膜到管

3、腔分布有各級生精細胞，包括精原細胞、精母細胞、圓形或長形精子細胞。然而，在犏牛曲細精管中，基底膜只分布有單層的精原細胞，精母細胞數(shù)量較少，幾乎沒有圓形或長形精子細胞。
　　2.在犏牛和牦牛睪丸表達差異蛋白中，排在前四位的上調(diào)蛋白是 PTX3，S-100，H1.0和Osteoglycin，其差異倍數(shù)分別為3.8，3.5，3.1和2.9，相比之下，排在前四位下調(diào)蛋白是MHC class II，Ropporin-1，SNRPF prot

4、ein和Protamine2，差異倍數(shù)分別為-6.9，-4.7，-4.5和-4.2。
　　3.大量上調(diào)蛋白可能參與多種應(yīng)激反應(yīng)（特別是炎癥性應(yīng)激）、增強生精細胞間黏附性或抑制生精細胞向曲細精管管腔的遷移。一些高表達蛋白（ICAM1，微纖絲相關(guān)糖蛋白4（MFAP4），胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白前體7（IGFBP7），Dermatopontin（DPT），整合素α9（ITGA9），整合素β1（ITGB1）可以提高細胞的粘附力，阻礙生殖細

5、胞從基底膜脫離向生精小管管腔內(nèi)遷移。
　　4.許多下調(diào)蛋白與精子發(fā)生過程中各種代謝過程和細胞過程的缺陷有關(guān)。PIWIL1和TDRD1表達下降可能影響PIWI或piRNA在保護生殖細胞基因組的完整性的功能；Gpx4在精母細胞中耗竭，引起精子嚴重異常，這可能也是雄性不育的原因；線粒體細胞色素BC1復合體亞基2、7和9的下調(diào)，與阿爾茨海默病的途徑和氧化磷酸化有關(guān)，這可能會導致線粒體功能障礙和犏牛睪丸生殖細胞凋亡；PSME4是一種大量表達

6、的核蛋白，PSME4的缺失，導致雄性生育能力明顯下降，總之，參與各種代謝過程的蛋白表達下調(diào)可能導致精子發(fā)生阻滯。
　　5.本研究通過對465個差異表達蛋白在KEGG數(shù)據(jù)庫通路富集，共獲得了15個顯著富集通路，其中排在前五的是細胞外基質(zhì)受體相互作用（P=0.0003843598），蛋白質(zhì)的消化和吸收（P=0.0007844198），阿爾茨海默氏?。≒=0.002146642），核糖體（P=0.004046523）和磷酸戊糖通路（P=

7、0.006084241）。在細胞外基質(zhì)受體相互作用通路中，整合素及其配體的過表達（細胞外基質(zhì)）可能有助于生精細胞耐受拉力而不被牽離。通過對阿爾茨海默病和氧化磷酸化通路的綜合分析表明，諸如線粒體細胞色素BC1復合體亞基等蛋白的下調(diào)可能導致犏牛睪丸細胞線粒體功能障礙和細胞凋亡。
　　6.本研究同樣采用iTRAQ方法研究不同發(fā)育階段的犏牛睪丸蛋白組的差異（P1-10月齡，P2-12月齡，P3-14月齡）。P2與P1階段相比，蛋白質(zhì)組分析

8、鑒定出318個差異表達蛋白，P3與P1階段相比,共有327個差異表達蛋白。P2與P1，P3與P1相比，差異表達的蛋白GO注釋并沒有明顯的差異，這可以歸因于它們的早期發(fā)育過程中的犏牛睪丸生精就受到阻滯。另一方面，P2，P3與P1階段相比，有56共同差異表達的蛋白，大部分蛋白與催化、分子轉(zhuǎn)運、氧化還原酶和蛋白結(jié)合相關(guān)。進一步分析表明，差異表達的蛋白包括HBPs，Tudor domain containing1，HSPA2，17_HSDXI，